上一回，招財貓講述了蛋白質檢測的幾種常用方法，基于質譜技術的 label free、iTRAQ/TMT、DIA、PRM 以及基于免疫技術的液相懸浮芯片。這一回，招財貓來講述一篇蛋白組學的文章。

我們以前熟悉的研究，往往從轉錄組起始，測得轉錄組數據后，尋找差異表達顯著的基因。然后，分別有生物標志物方向和機制研究方向，兩種套路成文。蛋白組學也有類似的套路。今天，招財貓講述的文章是機制研究方向的。我們來看下吧！

文章展示

文章如上，我們一看標題就知道是機制方向：XX 基因導致某種疾病進展（惡化∕好轉），通過 XX 通路。本文研究的疾病是黑素瘤（melanoma），關注的點是黑素瘤轉移（melanoma metastasis）。

研究思路

首先，樣本是建立的轉移細胞株。圖 1 說明細胞系建立方法，并驗證了一些關鍵的指標證明細胞系已建立。建立方法是將小鼠黑色素瘤細胞系 B16F10，及人黑色素瘤細胞系 A375 通過尾靜脈注射進小鼠體內，取肺轉移組織，取原代細胞進行培養，得到相應的轉移細胞株 B16F10M 和 A375M。下圖展示了形態（偽足形態），并表達了更高的增殖細胞核抗原（PCNA），證明構建是成功的。

圖 1

然后，取細胞株 B16F10 和 B16F10M，進行 iTRAQ 蛋白定量檢測。發現，轉移性 B16F10M 細胞株中 WDR74 的表達較對照組 B16F10 細胞株增加（差異倍數 =2.25，p<0.01）。然后用 qPCR 驗證了 RNA 水平上、免疫印跡驗證蛋白水平上的 WDR74，在兩種細胞中，WDR74 確實存在差異表達——招財貓說，這次 RNA 水平和蛋白水平一致了，沒有落入那“60%”里面去（有了 RNA-seq,，還需要蛋白質檢測嗎？）。

圖 2

在真實組織里也檢測了 WDR74 的表達，結果顯示，從正常皮膚發展到痣到原發性黑色素瘤再到轉移性黑色素瘤，WDR74 的表達是不斷增加的（圖略）。

到此，由高通量的蛋白組學方法（本文是 iTRAQ）篩選到了 WDR74，然后由低通量的 qPCR 和免疫印跡驗證表達。所以我們的目標分子選定了，下面就是進行功能研究了。

細胞實驗

采用 A375 細胞系，對 WDR74 進行過表達和敲除，其中敲除采用的是 CRISPR/Cas9 方法，具體介紹請見招財貓以前的文章（CRISPR∕Cas9 基因編輯技術），然后檢測了細胞表型，這里檢測的是細胞周期、增殖、凋亡、轉移和侵襲（基本把所有細胞表型都做了）。結果表明，WDR74 在 A375 細胞中，能促進細胞周期的進展和細胞增殖，并抗細胞凋亡——是的，邏輯上與之前的病理結果相符，將 WDR74 與黑素瘤轉移的相關性，進一步證明為因果關系（原文圖 2、3）。

機制研究

本文的思路是，發掘前期的研究結果，聯系本次發現的新分子。前期的眾多研究顯示，在多種腫瘤中，腫瘤的進展與 RP–MDM2–p53 通路相關。那么 WDR74 是否也與此通路相關？還是采用 A375 的 WDR74 過表達和敲除細胞株，先關注一下通路蛋白在過表達和敲除細胞株里的表達變化，進行 Western Blot。結果表明，p53、MDM2、RPL5 的表達量，都與 WDR74 的表達量相關，并且，p53 的下游基因，VEGFA、caspase 等，也都與 WDR74 的表達量相關。

圖 3

機制還需要證明相互作用。作者證明，WDR74 對于 p53 和 MDM2 的結合是必需的。

圖 4

作者還進行了拯救實驗，在已建立的 WDR74 的過表達和敲除穩定株的基礎上，轉入了 p53、MDM2 的 siRNA，然后檢測各相關分子的表達，及細胞的增殖。這些結果要與前面的單 WDR74 的過表達及敲除穩定株的結果相比，表明了上下游的邏輯關系——在此分子上游的仍受 WDR74 影響，在此分子下游的不受 WDR74 影響。圖 F 證明了 p53 是位于通路的下游，切斷 p53 這環就切斷了 WDR74 對細胞的影響。圖 G 表明 RPL5 是 MDM2 的上游，p53 是 MDM2 的下游。

圖 5

機制圖

根據以上邏輯關系，作者畫了一個機制圖：

圖 6

動物實驗

在裸鼠中，注射 WDR74 的過表達和敲除穩定株進行成瘤實驗。結果表明，WDR74 促進了黑素瘤瘤體生長和遠端轉移。原文圖 6。

文章點評

招財貓點評：從這個文章的套路看來，此蛋白組的機制文章與轉錄組的機制文章基本一樣，都是用組學進行篩選，低通量驗證選取的蛋白的表達，然后選取特定基因，進行功能研究。功能研究，還是我們原來講過的那套方法，過表達和敲除，在細胞模型中檢測表型，驗證機制，在動物模型中進一步驗證表型。

總之，本文結構非常完整，并且中規中矩，算是一篇還不錯的文章。要使文章 blingbling 地閃閃發亮，似乎做到這種程度還不夠。要怎樣才可以呢？請跟緊招財貓，后續介紹！

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