研究背景

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA) 的診斷主要基于臨床癥狀和類風(fēng)濕因子（RF)，抗瓜氨酸肽抗體（抗 CCP) 的血清學(xué)陽(yáng)性，而銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA) 只有臨床和影像學(xué)特征有助于診斷。雖然大多數(shù) RA 患者 RF，抗 CCP 血清陽(yáng)性，但約 15%-20% 的 RA 病例中，血清中 RF 和抗 CCP 水平并未升高，由于血清陰性 RA(negRA) 和 PsA 的癥狀非常相似，且沒有可靠的臨床標(biāo)志物，因此  , 兩者的鑒別診斷十分困難。由于治療方法不同，可靠的診斷對(duì)于開出正確的治療處方很重要。此外，導(dǎo)致 RA 和 PsA 患者特征性關(guān)節(jié)破壞的慢性炎癥過程可能會(huì)引起細(xì)胞、組織和器官代謝的重大和不同程度的改變。這些代謝改變導(dǎo)致血清代謝物和脂質(zhì)體的改變。因此研究者對(duì) negRA 和 PsA 患者血清進(jìn)行了基于 1H NMR 的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析，識(shí)別 negRA 和 PsA 患者血清中濃度不同的代謝物和脂類。從這些數(shù)據(jù)中推導(dǎo)出一個(gè)模型，將患者分類為兩種疾病類別中的一種，隨后進(jìn)行了盲法驗(yàn)證隊(duì)列分析，確定生物標(biāo)志物來提高這些疾病的鑒別診斷。

實(shí)驗(yàn)方法

檢測(cè)方法：靶向代謝組學(xué)，脂質(zhì)組學(xué)

檢測(cè)平臺(tái)：NMR

樣本分組：negRA 患者 =49 例；PsA 患者 =73 例

研究結(jié)果

核磁共振波譜分析

使用 TopSpin 3.6.2 軟件（Bruker BioSpin GmbH) 處理 NMR 譜。使用 AMix 軟件整合單個(gè)已鑒定代謝物的相關(guān)光譜區(qū)域以進(jìn)行定量。代謝物濃度的 jué對(duì)定量是通過比較來自每個(gè)代謝物的信號(hào)積分與富馬酸內(nèi)標(biāo)的信號(hào)積分來實(shí)現(xiàn)的。

在 1H 單脈沖 NMR 譜中，同時(shí)觀察到來自小分子和大分子的峰，導(dǎo)致基線不均勻和來自不同化合物的信號(hào)重疊。盡管如此，由于其特有的光譜特征，可使用 1HNMR 來識(shí)別和定量血清中的脂質(zhì)。如圖 1A 所示，圖中有七組脂質(zhì)信號(hào)（L1-L7）：L1：脂質(zhì)甲基；L2：脂質(zhì)脂肪鏈；L3：脂質(zhì) β - 亞甲基；L4：脂質(zhì)烯丙基亞甲基；L5：脂質(zhì) α - 亞甲基；L6：脂質(zhì)多不飽和烯丙基亞甲基；L7：脂質(zhì)烯烴。

在 CPMG NMR 譜中，通過抑制來自脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的寬信號(hào)，所得的低分子化合物的峰不會(huì)被來自大分子的信號(hào)所掩蓋，且具有清晰的信號(hào)和明確的基線，因此可以更好地識(shí)別和分析小分子產(chǎn)生的信號(hào)。如圖 1B 所示，研究者選擇了 24 中代謝物檢測(cè)：(1) 甲酸，（2）組氨酸，（3）苯丙氨酸，（4）酪氨酸，（5）α- 葡萄糖，（6）脯氨酸，（7）乳酸，（8）肌酐，（9）肌酸，（10）磷酸肌酸，（11）蘇氨酸，（12）膽堿，（13）肌氨酸；（14）檸檬酸鹽，（15）谷氨酰胺，（16）琥珀酸鹽，（17）乙酰乙酸鹽，（18）谷氨酸鹽，（19）乙酸鹽，（20）丙氨酸，（21）β- 羥基丁酸酯，（22）纈氨酸，（23）異亮氨酸和（24）亮氨酸。

圖 1   PsA 和 negRA 患者的光譜特征：1H 單脈沖（A) 和 CPMG NMR（B）

多變量統(tǒng)計(jì)分析

對(duì) 1H 單脈沖和 CPMG NMR 光譜進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，以確定是否存在可區(qū)分兩種疾病的特征光譜圖或峰。根據(jù)偏 zuì小二乘判別分析（PLS-DA）和隨機(jī)森林模型，臨床或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)協(xié)變量與 1H（圖 1）和 CPMG（數(shù)據(jù)未顯示）光譜區(qū)域之間沒有顯著相關(guān)性。

圖 2    顯示了臨床 / 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量與 1H 光譜區(qū)域之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)，以及用于發(fā)現(xiàn)隊(duì)列，PsA 和 negRA 組的歐幾里德度量的分層聚類

由于基于主成分分析的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的聚類通常很困難，用偏  zuì  小二乘法（PLS-DA) 對(duì) 1H 和 CPMG 光譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行評(píng)價(jià)。主成分 1 - 5 表明了 1H 數(shù)據(jù)方差 =96.9%/CPMG 數(shù)據(jù)方差 =84.6%，但聚類并不明顯，無法清晰區(qū)分 PsA 和 negRA 患者（圖 3A)。

圖 3A  五個(gè)主成分之間的成對(duì)得分曲線圖，對(duì)角線上顯示相應(yīng)的方差。

在評(píng)估 PLS-DA 模型的質(zhì)量時(shí)，其準(zhǔn)確度≤65%，R2 和 Q2 值都非常低（1H 光譜：R2 = 0.13，Q2 = 0.06；CPMG 光譜：R2 = 0.16，Q2 = 0.08）。為了提高基于光譜模式的診斷準(zhǔn)確性，研究者使用了隨機(jī)森林分類算法，因?yàn)樗鼘?duì)高維數(shù)據(jù)分析具有穩(wěn)健性。在 1H 和 CPMG 光譜中，該算法鑒定了對(duì) negRA 和 PsA 患者進(jìn)行分類的相似區(qū)域，基于 1H 的分類 oob error=0.361，基于 CPMG 的分類 oob error=0.336（圖 3B,C）。盡管如此，通過隨機(jī)森林算法確定的重要光譜區(qū)域仍被用于聚焦目標(biāo)分析。

圖 3B  隨機(jī)森林確定的顯著特征。

圖 3C 隨機(jī)森林分類的累積錯(cuò)誤率。

(紅：總體；藍(lán)：RA；綠：PsA)

目標(biāo)代謝物，脂類聚焦分析

在定量代謝物和脂質(zhì)組的濃度后，通過單變量分析確定患者組之間的差異。在 24 種代謝物中，兩種患者組中的 9 種具有明顯不同的濃度，即氨基酸（AA）：丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸和纈氨酸以及有機(jī)化合物乙酸鹽，膽堿，肌酸和乳酸。

另外發(fā)現(xiàn) negRA 和 PsA 患者之間的脂質(zhì)比率 L3 / L1，L5 / L1 和 L6 / L1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異在 PsA 中均較高（圖 4A）。比較兩組時(shí)，某些代謝途徑明顯富集（圖 4B）。

圖 4（A）目標(biāo)分析中包括的代謝物和脂質(zhì)比率的點(diǎn)狀圖，這些點(diǎn)狀圖顯示了發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中兩個(gè)患者組之間的顯著差異。線表示平均值和 95%CI。（B）定量富集分析的摘要條形圖，顯示發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中 negRA 和 PsA 代謝組之間的變化。

多元方差分析（MANOVA）

年齡，性別和治療方案可能會(huì)影響不同疾病中生物體液中代謝物的濃度，從而影響要用于初治患者或不同年齡患者的生物標(biāo)志物的定義。為了分析任何臨床或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)是否可能對(duì) 24 種代謝物或脂質(zhì)組的血清濃度產(chǎn)生影響，研究者對(duì)相關(guān)代謝物和潛在代謝物進(jìn)行了多元方差分析（MANOVA）。

結(jié)果表明（表格未展示）疾病活動(dòng)與膽堿濃度，L2 / L1 和 L7 / L1 的變化有關(guān)，而疾病持續(xù)時(shí)間與檸檬酸鹽，磷酸肌酸，葡萄糖，組氨酸，酪氨酸和纈氨酸濃度的變化有關(guān)。當(dāng)將年齡和體重指數(shù)類別與疾病組結(jié)合時(shí)，代謝物濃度和脂質(zhì)比率的變化同樣可見。盡管 RA 是一種主要影響女性的疾病，與 PsA 相反，但 MANOVA 分析結(jié)合了疾病類別和性別，在相關(guān)代謝產(chǎn)物上沒有任何顯著差異。當(dāng)疾病和治療相結(jié)合時(shí)，情況類似。單變量分析顯示代謝物濃度或脂質(zhì)比率與臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量之間有沒有任何顯著相關(guān)。如圖 5

圖 5 顯示臨床或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量與代謝物之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)，并使用歐幾里德度量對(duì)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的 PsA 和 negRA 組進(jìn)行分層聚類。

用于患者分類的多元診斷模型

單一代謝物或脂質(zhì)比例的  ROC 分析得到的曲線下面積（AUC) 小 70%。因此，單變量模型對(duì) PsA 和 negRA 患者的鑒別的敏感性和特異性低。為了達(dá)到高的診斷準(zhǔn)確率，研究者建立了三種不同的機(jī)器學(xué)習(xí)算法：隨機(jī)森林算法、樸素貝葉斯算法和多元 Logistic 回歸算法，對(duì) 73 例 PsA 和 49 例 negRA 患者的代謝組和脂質(zhì)組進(jìn)行了分析。隨機(jī)森林預(yù)測(cè) PsA 的準(zhǔn)確率 73.3%(Cohen‘s kappa 40.1%)，樸素貝葉斯準(zhǔn)確率為 63.7%(Cohen’s kappa 26.5%)。

通過逐步向前 - 向后選擇算法，以下診斷預(yù)測(cè)因子已包括在診斷模型中：年齡，性別，L6 / L1，L5 / L1，L2 / L1，丙氨酸，琥珀酸和磷酸肌酸。

在驗(yàn)證過程中，使用十折交叉驗(yàn)證對(duì)所得到的模型進(jìn)行評(píng)估，這產(chǎn)生了表 1 中的系數(shù)估計(jì)。

表 1 模型系數(shù)的評(píng)估

將這些估計(jì)值應(yīng)用到回歸模型中會(huì)產(chǎn)生以下公式：

每種代謝物的濃度、年齡和性別（男性 =1，女性 =0) 代入公式中。然后，通過替換在 F1 中獲得的結(jié)果×來計(jì)算屬于 PsA 組的概率：

患者屬于 negRA 組的概率由下式給出：

將患者分為兩組，需計(jì)算概率（F2) 的分界值。通常應(yīng)用分界值 0.5，PPsA>0.5，則將其分類為 PsA，這反映了將對(duì)象分類為更有可能進(jìn)行診斷的想法。圖 6 為發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中交叉驗(yàn)證的建模概率 PPsA 的 ROC 曲線，該圖顯示了該模型對(duì)此臨界值的敏感性和特異性，ROC 曲線下的總面積（AUC) 為 84.5%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證從交叉驗(yàn)證過程中檢索到的模型，研究者收集了 35 名新的關(guān)節(jié)炎患者的單獨(dú)的盲法樣本。該隊(duì)列與用于建立診斷模型的隊(duì)列具有相似的路徑分布（圖 7)。使用臨界值 0.5 對(duì)盲法隊(duì)列進(jìn)行評(píng)估，得出了 62.9% 的患者的正確預(yù)測(cè)，并進(jìn)行了 ROC 分析，其中 AUC 降至 71.6%(圖 8)。

在診斷預(yù)測(cè)后，對(duì) 13 名預(yù)測(cè)診斷與風(fēng)濕科醫(yī)生  zuì  初所做的診斷不同的患者進(jìn)行了臨床重新評(píng)估。對(duì)于這些患者中的 4 名，仍然無法確定診斷，因?yàn)樗麄円恢比狈Κ?dú)特的臨床參數(shù)。研究者從驗(yàn)證隊(duì)列中刪除了這四個(gè)個(gè)體，重新計(jì)算了預(yù)測(cè)匹配率，增加到 71.0%，并進(jìn)行了新的 ROC 分析，結(jié)果提高了敏感度（62.5%) 和特異度（80.0%)(圖 9)。

▲圖 6

▲ 圖 8

結(jié)論

為驗(yàn)證其在基因異源人群中的有效性，還需要在更大的多國(guó) / 多民族隊(duì)列中進(jìn)行測(cè)試。盡管如此，研究者的研究有助于將 1HNMR 的代謝組學(xué)這一技術(shù)擴(kuò)展到自身免疫病理學(xué)的常規(guī)診斷技術(shù)鋪平道路。即使臨床特征相似，與風(fēng)濕性疾病相關(guān)的代謝組學(xué)過程在疾病之間也有所不同。因此，代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)開始為自身免疫研究提供一個(gè)全新的領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

Margarida souto-carneiro，lilla Tóth,rouven Behnisch，et al. Differences in the serum metabolome and lipidome identify potential biomarkers for seronegative rheumatoid arthritis versus psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis.2020; 79(4):499-506.

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