文章題目：A plasma membrane transporter coordinates phosphate reallocation and grain filling in cereals

磷（Pi) 對(duì)植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量至關(guān)重要。然而，在籽粒灌漿過(guò)程中 Pi 穩(wěn)態(tài)是如何維持的還不清楚。在本研究中，何祖華課題組通過(guò)圖位克隆鑒定了一類關(guān)于水稻籽粒灌漿調(diào)控 Pho1 -Pi 的品系：OsPHO1;2。且發(fā)現(xiàn)該品系在灌漿過(guò)程中 Pi 重新分配中的特殊作用有關(guān)。 伯豪生物為何祖華課題組提供了 RNA-seq 服務(wù)，發(fā)現(xiàn) PHO1；2 通過(guò)影響 AGPase 的活性進(jìn)而影響水稻灌漿過(guò)程中 Pi 重新分配的作用機(jī)制。AGPase 對(duì)淀粉合成至關(guān)重要，而在 Ospho1;2 突變體植株中，AGPase 的過(guò)表達(dá)緩解了籽粒灌漿缺陷。該機(jī)制在玉米中得到了證實(shí)， 為在谷物生長(zhǎng)過(guò)程中以較小的磷肥投入來(lái)提高籽粒產(chǎn)量，提供了有效方案。

籽粒灌漿突變體 OsPHO1;2 的表型及圖位克隆

何祖華課題組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)自然發(fā)生的籽粒灌漿較差表型的水稻突變體品系。該缺陷表型由一個(gè)隱性位點(diǎn)控制，經(jīng)過(guò)基因克隆后分別命名為 NIL-OsPHO1 和 NIL-OsPHO2。NIL-OsPHO2 的籽粒表現(xiàn)出典型的灌漿缺陷，淀粉粒松散、排列不整齊，導(dǎo)致籽粒變薄、皺縮，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。除分蘗數(shù)減少（圖 1) 外，其余突變體植株正常。在整個(gè)種子發(fā)育過(guò)程中，植株的千粒重減少了近一半（圖 1e)。與 gif1 突變株不同，NIL-OsPHO1 的淀粉含量更少，可溶性糖更多，對(duì)白葉枯病的抗性更強(qiáng)（圖 1)。這表明，這兩種突變體具有不同的生理表型。在該區(qū)域作者鑒定了一個(gè)單基因 LOC_Os02g56510，該候選基因編碼 PHO1 家族的 Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。為了確定 NIL-OsPHO1；2 的原因突變，作者對(duì)其 5kb 區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在 OsPHO1;2 的第 7 外顯子中有 1 -bp 的缺失，導(dǎo)致編碼序列的幀移和過(guò)早終止。作者還在第 1 外顯子和第 3 外顯子中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)同義 SNP，在第 12 內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè) SNP。為了確定這一缺陷灌漿表型是否是由 OsPHO1;2 突變引起的，作者在 Nipponbare (NIP) 中構(gòu)建了 8 個(gè) CRISPR/Cas9 敲除株系，分別為 OsPHO1;2 -ko1 到 OsPHO1;2 -ko8，這些株系均表現(xiàn)出與 NIL-Ospho1;2 相同的灌漿缺陷（圖 1)。

PHO1;2 是一種在種子發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)的質(zhì)膜蛋白。通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄 PCR (qRT - PCR) 發(fā)現(xiàn)，除了在幼穗、外殼和根中表達(dá)外，OsPHO1;2 在發(fā)育中的種子中也有高表達(dá)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中 2 -β- 葡萄糖醛酸酶（GUS) 報(bào)告基因的組織學(xué)分析，證實(shí)了該表達(dá)模式（圖 2a)。同樣，從開花后 0 d(穗）到 30 d( 穗）的整個(gè)灌漿階段，OsPHO1;2 蛋白均在籽粒中富集。為了進(jìn)一步研究 OsPHO1;2 的細(xì)胞特異性，作者在籽粒灌漿早期的種子樣本中進(jìn)行了抗 OsPHO1;2 抗體的免疫熒光試驗(yàn)。有趣的是，在種子的珠心表皮（NE) 和胚珠脈管系統(tǒng)（OV) 中檢測(cè)到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，這些細(xì)胞起著向胚乳裝載和排出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用 m3(圖 2c)。在 I 節(jié)維管束中也發(fā)現(xiàn)了熒光信號(hào)（圖 2d)，這有助于水稻植株中的養(yǎng)分分布。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了 OsPHO1;2 在發(fā)育中的種子不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在胚胎、胚乳、果皮和 NE 中都可以檢測(cè)到 OsPHO1;2 mRNA 和 OsPHO1;2 蛋白。此外，利用含有 pOsPHO1;2- Gus 報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步驗(yàn)證了 PHO1;2 在種子中的定位。作者將一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP) 與 OsPHO1;2 融合進(jìn)入水稻鞘原生質(zhì)體和洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在這兩種情況下，OsPHO1;2 - GFP 主要定位于質(zhì)膜（圖 2)。細(xì)胞內(nèi)偶爾可見微弱的熒光信號(hào)，提示部分 OsPHO1;2 蛋白可能定位于細(xì)胞內(nèi)隔間。綜上所述，這些結(jié)果表明，OsPHO1;2 是一種質(zhì)膜定位蛋白，在發(fā)育中的種子 NE 和維管組織中高表達(dá)。

OsPHO1;2 是 Pi 的轉(zhuǎn)運(yùn)體

由于沒有直接證據(jù)表明植物 Pho1 型蛋白，如 OsPHO1;2 等是 Pi 的轉(zhuǎn)運(yùn)體。值得注意的是，雖然 Ospho1;2 幼苗比野生型（WT) 幼苗生長(zhǎng)早期，可能由于缺陷胚乳提供的能量較少，它們后來(lái)恢復(fù)了 WT 的高度。這些生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)表明，OsPHO1;2 可能不是整個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，但在籽粒灌漿過(guò)程中是必不可少的。為了分析 OsPHO1;2 蛋白在籽粒灌漿和 Pi 穩(wěn)態(tài)中的作用機(jī)制，作者試圖通過(guò)三種不同的異源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)確定 OsPHO1;2 蛋白是否確實(shí)作為 Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)體。首先，作者發(fā)現(xiàn) OsPHO1;2 補(bǔ)充了酵母突變體 EY917 的生長(zhǎng)表型，該突變體缺乏 5 個(gè)負(fù)責(zé) Pi 攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)體（pho84?，pho87?，pho89?，pho90?，pho91?)，這證明了 OsPHO1;2 可能具有 Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)活性。主要的外排活性可能介導(dǎo)了木質(zhì)部的 Pi 負(fù)荷，從而解釋了先前的遺傳分析顯示它們?cè)诟降厣喜?Pi 轉(zhuǎn)移中的作用。為了將 OsPHO1;2 在 Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用與 Pi 穩(wěn)態(tài)聯(lián)系起來(lái)，作者比較了近距離接觸的幼苗之間的 Pi 水平。在缺 Pi 或正常供應(yīng) Pi 條件下，突變株根系中 Pi 含量增加，而地上部 Pi 含量降低。因此，OsPHO1;2 突變損害了 Pi 從根到莖的轉(zhuǎn)移，這與之前的結(jié)果一致。此外，31P NMR 分析顯示，突變體幼苗根細(xì)胞中胞質(zhì)和液泡中 Pi 含量明顯較高，排除了 OsPHO1;2 參與胞質(zhì) - 液泡劃分的可能性（圖 3)。接下來(lái)，作者研究了成熟期植株地上部組織中 Pi 的分布，發(fā)現(xiàn)在節(jié)、殼和糙米中，NIL-Ospho1;2 和 Ospho1;2-ko1 植株中 Pi 的含量均高于 WT 植株，但葉片中 Pi 的含量較低。表明 OsPHO1;2 可能參與了 Pi 在種子和葉片之間的重新分配。

為了支持上述假設(shè)，作者進(jìn)行了測(cè)量在整個(gè)灌漿過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該突變體的 Pi 含量較高（圖 3e)。由于 OsPHO1;2 在發(fā)育中的種子 NE 組織中高度表達(dá)，我們比較了 NE 周圍胚乳和果皮中 Pi 的含量，發(fā)現(xiàn)在 Nilosho1;2 種子中，這些組織中 Pi 的含量顯著增加。因此，在 Ospho1;2 突變體中，Pi 的再分配受到了干擾。而突變體種子中總磷含量顯著降低（圖 3f)，微 x 射線熒光（μXRF) 成像結(jié)果一致（圖 3g)。這說(shuō)明突變株的有機(jī)磷合成可能由于種子中母、子組織間 Pi 交換的中斷而減少。因此，我們得出結(jié)論，OsPHO1;2 作為 Pi 外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，將 Pi 從胚乳細(xì)胞中釋放出來(lái)，其功能的喪失導(dǎo)致 Pi 在種子中過(guò)量。過(guò)量的 Pi 積累抑制淀粉合成酶。為探討灌漿期 Pi 積累與灌漿之間的關(guān)系，作者對(duì)灌漿期 NILs 進(jìn)行了 RNA-seq 比較分析，鑒定出大量差異表達(dá)的基因。作者發(fā)現(xiàn)許多參與淀粉和糖代謝的基因被富集。此外，作者通過(guò) qRT-PCR 確定了幾個(gè)與淀粉合成相關(guān)的代表性基因的表達(dá)模式，包括編碼 AGPase、淀粉合酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶 29(圖 4a)。這些基因在 Ospho1;2 突變體中大部分被下調(diào)，這與該突變體在淀粉合成方面的缺陷相一致。免疫印跡和同工酶分析顯示，突變體種子中參與淀粉合成的幾個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白水平或酶活性也有所下降（圖 4)。在這些酶中，AGPase 催化淀粉合成的步驟一，從 G -1- P 和 ATP 中生成 ADP-Glc 和 PPi, AGPase 的功能障礙會(huì)導(dǎo)致籽粒灌漿缺陷，這與 Ospho1;2 突變體中發(fā)現(xiàn)的缺陷類似，表明 AGPase 在籽粒灌漿過(guò)程中起著不可或缺的作用。