一般我們拿到 10x 空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果先看的肯定是 web_summary 網(wǎng)頁(yè)報(bào)告，因?yàn)閺倪@個(gè)結(jié)果里面我們大概就能判斷你的數(shù)據(jù)好不好，不好的問(wèn)題在哪里，數(shù)據(jù)到底能不能用等等。這里來(lái)詳細(xì)介紹一下怎么看 10x 空間轉(zhuǎn)錄組 web_summary 網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告。

10x  空間轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告模板如下：

下面來(lái)詳細(xì)介紹一下每塊區(qū)域每個(gè)指標(biāo)的含義。

Reads 總體情況統(tǒng)計(jì)區(qū)：

Number of Reads：樣本總的測(cè)序 reads 數(shù)，雙端測(cè)序這個(gè)是指一端的 reads 數(shù)，實(shí)際上算數(shù)據(jù)量需要用 reads*2* 讀長(zhǎng)。

Valid Barcodes：barcode 校準(zhǔn)后有效的 barcode 數(shù)占總的 reads 的比例，Space Ranger 會(huì)先嘗試糾正 barcode 序列中的序列錯(cuò)誤，然后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

Valid UMIs：有效的 UMI 數(shù)占總的 reads 的比例。

Sequencing Saturation： 測(cè)序飽和度值，就是在當(dāng)前測(cè)序深度情況下，有多少比例的捕獲到的 mRNA 被測(cè)出來(lái)了，比如這這里的測(cè)序飽和度是 74%，說(shuō)有 74% 的 mRNA 基因被檢測(cè)出來(lái)了，如果加大測(cè)序深度會(huì)有更多的 mRNA 被檢測(cè)出來(lái)。

Q30 Bases in Barcode：barcode 序列的 Q30 值

Q30 Bases in RNA Read：捕獲的 mRNA 序列的 Q30 值

Q30 Bases in UMI：UMI 序列的 Q30 值

Mapping 結(jié)果統(tǒng)計(jì)區(qū)：

Reads Mapped to Genome：比對(duì)到基因組上 reads 的比例

Reads Mapped Confidently to Genome：先進(jìn)比對(duì)到基因組上 reads 的比例，也就是我們常說(shuō)的 mapped uniquely reads，不過(guò)這里如果某條 reds 先進(jìn)比對(duì)到一個(gè)基因的 exon 區(qū)，同時(shí)又比對(duì)到了一處非 exon 區(qū)，還是算先進(jìn)比對(duì)到 exon 區(qū)的 reads。

Reads Mapped Confidently to Intergenic Regions：比對(duì)到先進(jìn)基因間區(qū)的 reads 的比例

Reads Mapped Confidently to Intronic Regions：比對(duì)到先進(jìn)內(nèi)含子區(qū)的 reads 的比例

Reads Mapped Confidently to Exonic Regions：比對(duì)到先進(jìn)外顯子區(qū)的 reads 的比例

Reads Mapped Confidently toTranscriptome： 比對(duì)到先進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄組上 reads 的比例，這一部分會(huì)包括剪切位點(diǎn)的 reads。這一部分的 reads 就是用來(lái)對(duì) UMI 進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)的。細(xì)心的朋友可能會(huì)發(fā)現(xiàn)這一部分的 reads 比例比 Reads Mapped Confidently to Exonic Regions 的值要低，這是因?yàn)橛行┗虻?exon 是有 overlap 的，處于 overlap 區(qū)域的 reads 是不進(jìn)入 UMI 計(jì)數(shù)的。

Reads Mapped Antisense to Gene：比對(duì)到基因轉(zhuǎn)錄組的反義鏈區(qū)域的 reads 比例，這部分 reads 是沒(méi)有意義的。從這里我們也可以發(fā)現(xiàn) 10x 空間轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)和比對(duì)有方向性的。

Spot 信息統(tǒng)計(jì)區(qū)：

Fraction Reads in Spots Under Tissue：比對(duì)到先進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄組上 reads（Reads Mapped Confidently to Transcriptome）有多少比例覆蓋在組織區(qū)域的 spot 上，這里是 93%，那就說(shuō)明只有 7% 的 reads 分布在組織之外的灰色區(qū)域的。10x 軟件在這里有一個(gè)默認(rèn)的閾值為 50%，認(rèn)為這個(gè)比例值超過(guò) 50% 結(jié)果是正常的，低于 50% 則回到網(wǎng)頁(yè) zuì 上面區(qū)域提示報(bào)錯(cuò)信息（認(rèn)為可能是透化不完全導(dǎo)致背景 RNA 過(guò)高或者是組織區(qū)域選的不合適）。從這個(gè) 50% 的閾值上我們也可以判斷 10x 的這個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還是存在一定缺陷的，它允許接近 50% 的 reads 散落在組織以外的區(qū)域，說(shuō)明組織透化這一步想讓對(duì)應(yīng)區(qū)域的 mRNA 完全都落入對(duì)應(yīng) spot 點(diǎn)里面去還是很難的。

Mean Reads per Spot：每個(gè) spot 的平均 reads 數(shù)，10x 這里采用的是所以測(cè)序 reads 總是除以組織上檢測(cè)到的 spot 數(shù)（跟單細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)方法是一樣的），理論上來(lái)說(shuō)這樣統(tǒng)計(jì)是不合理的，因?yàn)榭偟?reads 包括沒(méi)有比對(duì)上的 reads、沒(méi)有 mapping 到轉(zhuǎn)錄本上的 reads、組織區(qū)域以外的 spot 上的 reads，所以是不能真實(shí)的反應(yīng)每個(gè) spot 上實(shí)際的 reads 數(shù)的。

Median Genes per Spot：每個(gè) spot 的基因中位數(shù)

Total Genes Detected：檢測(cè)到的基因總數(shù)

Median UMI Counts per Spot：每個(gè) spot 的中位 UMI 數(shù)

樣本信息區(qū)：

Sample ID：樣本 id

Chemistry：試劑版本

Slide Serial Number：Slide 信號(hào)和區(qū)域

Reference Path：參考基因組路徑

Transcriptome：基因組轉(zhuǎn)錄組版本

Pipeline Version：spaceranger 軟件版本

Analysis 區(qū)域

UMI 分布展示：左邊是圖像上 UMI 的分布，右邊是 tsne 降維可視化后的 UMI 的分布，鼠標(biāo)放置到圖像上會(huì)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)的位置信息和對(duì)應(yīng) spot 上的 UMI count 數(shù)。從這個(gè)圖我們可以判斷 UMI 主要分布在組織的哪些區(qū)域，哪些區(qū)域沒(méi)有捕獲到 mRNA 或捕獲的 mRNA 特別少。

Cluster 的分布展示：左邊是 cluster 在組織圖像上的分布，右邊是 tsne 降維可視化后的 cluster 的分布，鼠標(biāo)放置到圖像上會(huì)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)的位置信息和對(duì)應(yīng) spot 上的 cluster 值和該 cluster 占總的 spot 的比例。這個(gè)圖片上 cluster 分群在組織上的層次關(guān)系特別明顯。

這一部分主要展示亞群的 top 基因的信息，因?yàn)椴还苁菃渭?xì)胞還是空間轉(zhuǎn)錄組基本上后面都會(huì)自己另外重新分析的，所以這部分和上面的 cluster 分布信息意義不大。

Sequencing Saturation（測(cè)序飽和度）

對(duì) reads 進(jìn)行隨機(jī)抽樣，觀察不同 spot 平均 reads 的情況下測(cè)序飽和度的分析，一直到實(shí)際的測(cè)序深度測(cè)序飽和度的值，理論上當(dāng)所有轉(zhuǎn)化的 mRNA 轉(zhuǎn)錄本均已測(cè)序后，飽和度接近 1.0（100%），虛線(xiàn)表示測(cè)序到合理的飽和點(diǎn)位置，也就是說(shuō)就是測(cè)序深度再高也不可能飽和度達(dá)到 100%。

Median Genes per Spot（sopt 點(diǎn)的中位基因）

也是對(duì) reads 進(jìn)行隨機(jī)抽樣，觀察不同 spot 平均 reads 的情況下 spot 的中位基因的值，曲線(xiàn)高點(diǎn)的斜率能反應(yīng)增加測(cè)序深度能得到大的 spot 的中位基因數(shù)。

總結(jié)

對(duì)于 web_summary 的結(jié)果我們大概重點(diǎn)可以從下面幾個(gè)方面來(lái)看數(shù)據(jù)效果：

1、總的 spot 數(shù)，這個(gè)其實(shí)由組織的大小而定，沒(méi)有具體好壞的說(shuō)法；

2、每個(gè) spot 的中位基因數(shù)，中位基因數(shù)太少說(shuō)明捕獲效果不好，有可能透化步驟條件不夠優(yōu)化，當(dāng)然也有可能是試劑或芯片的問(wèn)題；

3、測(cè)序飽和度，每個(gè)點(diǎn)的 UMI 中位數(shù)，sopt 平均 reads 數(shù)，飽和度、sopt 平均 reads 數(shù)和中位 UMI 數(shù)都太低說(shuō)明測(cè)序深度不夠，需要加大測(cè)序量。

4、基因組的比對(duì)率，比對(duì)率太低有可能是樣品污染；

5、組織 spot 上 reads 的比例，比對(duì)太低有可能透化時(shí)間不夠?qū)е卤尘?RNA 過(guò)高，需要優(yōu)化透化條件，也有可能組織區(qū)域選的不好，這個(gè)可以通過(guò) LoupeBrowser 手動(dòng)選擇組織區(qū)域。

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