客戶單位： 廈門大學附屬中山醫院

期刊：Theranostics

影響因子：8.579

發表時間：2020.07.09

伯豪提供服務： 機器學習建模和免疫浸潤分析

具有完善基因表達數據和表型數據的大規模公共隊列為開發腫瘤預后標志提供了可能。近年來，機器學習作為人工智能（AI）的分支，已經被成功用于建立腫瘤患者預后和治療預測的模型。與此同時，近年來人們逐漸了解到腫瘤微環境的復雜性和多樣性，腫瘤微環境與腫瘤細胞相互作用，共同介導了腫瘤的免疫耐受，從而對腫瘤進程及治療產生重要影響。在這項研究中，作者整合了多個隊列和基因表達數據，開發驗證了一個基于基因集的胃癌預后特征（GPSGC），然后進一步分析 GPSGC 風險評分與腫瘤微環境的關系，探討了 GPSGC 評分相關的生存機制，并發現了潛在的治療靶點。

（1）發現階段：對 TCGA 和 ACRG 數據庫中的癌和癌旁進行基因差異表達分析，進一步通過 Cox 回歸分析初步獲得 22 個候選 marker。

（2）訓練階段：進一步應用 Stepwise Cox regression multivariate 分析篩選出基因組合，構建優秀的多元 Cox 回歸模型。

risk score = (0.14121 * expression of VCAN) + (0.19095* expression of CLIP4) + (0.13633 * expression of MATN3)

利用 X -tile 軟件獲得的 cutoff（0.15），從而將 TCGA-STAD 和 ACRG 隊列中的患者分為高風險組和低風險組。在 TCGA 隊列中，高風險評分患者（22.8%）的總生存率（OS）較低風險評分患者（77.2%）短（HR=2.296；95%CI:1.513-3.485；P<0.0001）；同樣的，在 ACRG 隊列中，高風險患者（30.7%）的 OS 較低風險患者（69.3%）短（HR=2.659；95%CI:1.836-3.849；P<0.0001）。

（3）驗證階段：為了確定 GPSGC 是否穩健，作者在三個獨立的 GEO 隊列中評估了 GPSGC 的性能，共包含 1057 名患者。與訓練隊列的結果一致，根據 GPSGC 被分配到高風險組的患者在多個 GEO 驗證隊列中的 OS 或 RFS 明顯比那些被分配到低風險組的患者差。

為了探討 GPSGC 的預后價值是否獨立于其他臨床因素，作者進行了多因素 Cox 回歸分析，結果表明，GPSGC 可以作為患者生存結局的獨立預測因子，從而證實了其獨立預測 GC 預后的穩健性。

基于多變量 Cox 分析，生成了一個整合了 GPSGC 和其他臨床變量的列線圖，以預測 TCGA-STAD 和 ACRG 訓練隊列的 GC 患者 3 年和 5 年總生存率的概率。

腫瘤微環境（TME）由細胞外基質（ECM）、間質細胞、免疫 / 炎癥細胞和分泌因子組成，與腫瘤的進展和治療反應密切相關。上述 GPSGC 風險模型中，VCAN、CLIP4 和 MATN3 蛋白的組織分布和細胞定位表明它們與腫瘤微環境（TME）有關。

（1）TME subcomponent analysis

為了進一步探討 GPSGC 背后的潛在機制，首先基于 ESTIMATE 算法將 TME 分為基質和免疫亞組分，并通過 ssGSEA 確定基質和免疫評分。Pearson 相關分析顯示，基質評分與 GPSGC 風險評分呈顯著正相關（r=0.645；P<1.0×10-6；）。此外，而基質評分高的 GC 患者總體生存率比基質評分低的患者差（HR=1.351；95%CI:1.107-1.647；P=0.0031）。

（2）TME cell type analysis

對于 TME 細胞類型分析，基于 xCell 算法預測 64 種 TME 細胞類型的比例，并通過 ssGSEA 確定每種細胞類型的富集分數。在 64 種 TME 細胞類型中，與 OS（log-rank test, P <0.05）和 GPSGC 風險評分（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P < 0.05）顯著相關的細胞共有 9 種類型。值得注意的是，占比大的五種間質細胞均與預后和 GPSGC 風險評分呈正相關。

（3）Panimmune gene set analysis

在泛免疫基因集分析中，利用 GSVA 對 110 條免疫調節相關通路的富集分數進行了估計，篩選與 OS（log-rank test, P <0.05）和 GPSGC 風險評分（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P < 0.05）顯著相關的基因集，得到 10 個泛免疫基因集，其中 8 個與不良結局和 GPSGC 風險評分呈正相關。

（4）immunomodulatory gene analysis

為了確定 GPSGC 相關的特異性分子靶點，在整個隊列中分析了 60 個免疫調節基因與 GPSGC 風險評分的相關性（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P <0.05）；。OS 分析進一步表明，只有三個免疫調節基因 VEGFB、TGFβ1 和 ENTPD1 顯著與不良結果相關。

由于所有與 GPSGC 和治療靶點相關的蛋白質都具有重要的生物學功能，進一步使用組織微陣列和多重熒光免疫組織化學（mfIHC）在蛋白質水平上進行實驗驗證。在 186 例 GC 患者的組織微陣列中，GPSGC 有效地將 59 名患者（31.7%）分為高危組，127 名患者（68.3%）分為低風險組。OS 分析還證明治療靶點 TGFβ1 和 VEGFB 的蛋白表達與不良預后顯著相關。VCAN、CLIP4 和 MATN3 的表達水平和與治療靶點 TGFβ1 和 VEGFB 的表達顯著相關。Pearson 相關分析顯示，GPSGC 風險評分與 TGFβ1 蛋白表達和 VEGFB 蛋白表達呈強正相關。

1、數據庫挖掘結合實驗驗證；

2、機器學習算法的運用；

3、多層面免疫浸潤分析；

4、預后模型與免疫微環境的關聯分析。