10x Genomics 在分析軟件這一塊還是非常給力的，開發的每個軟件都非常好用而且操作簡單，特別是安裝方便，基本解壓后就能用。對于 10x 的空間轉錄組數據主要用 10x 自己開發的 Space Ranger 來進行前期的處理。

軟件下載地址

https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest

可以直接點擊下載，也可以用下面的 curl 或 wget 命令下載。

基因組下載

在前面同一個頁面往下拉就能看到。

10x 提供了專門的用于空間轉錄組分析的基因組，目前較新的基因組版本是 2020 年 6 月更新的，基因注釋為 Ensembl 98 版本，主要包括人和小鼠。

系統要求

Linux 系統上運行底限要求：

• 8 核 Intel 或 AMD 處理器（建議使用 32 核）

• 64GB RAM（建議 128GB）

• 1TB 可用磁盤空間

• 64 位 CentOS / RedHat 6.0 或 Ubuntu 12.04

集群模式下運行需要額外滿足以下要求：

• 每個節點 8 核 Intel 或 AMD 處理器

• 每個內核 6GB RAM

• 共享文件系統（例如 NFS）

• SGE 或 LSF 批處理系統

軟件安裝

1，解壓 SpaceRanger 文件

2，解壓參考基因組文件

3，加入環境變量

輸入文件準備

Fastq 序列文件

10x 建議測序 read2 設置 90 個堿基的長度 。 從下面 10x 測試的 6 個樣本來看，reads 序列長度達到 70bp 以后，mapping 率就不太變化了，有些樣本在長度大于 90bp 以后 mapping 率反而下降了。10x 給出這樣的建議是考慮到建庫后插入片段太短的話，太長的序列里面會包含部分 polyA 甚至 UMI 序列反而影響比對效果。 因為國內目前基本上是測 2x150bp 的，如果建庫片段過短比對率較低的話建議將 read2 剪切成 90bp 來分析效果應該會好一點。

Fastq 文件名建議是如下格式的，以免運行報錯。

圖像文件：

Space Ranger 支持兩種樣式的顯微鏡圖像：用蘇木精和曙紅（H&E）染色的明場圖像，必須是 24 位彩色 TIFF，16 位灰度 TIFF 或 JPEG。Space Ranger 要求任一方向上的圖像至少為 2000 像素。

注意：圖像邊框的四個角位置是固定的，比如說 三角形在左下角 ，如果掃描出來的圖片四個角的位置變了需要先手動調整過來再使用。

軟件運行

一般我們拿到的都是直接是 fastq 序列文件了，所以可以直接跑 spaceranger count，不需要再去運行 spaceranger mkfastq 了。

spaceranger count 運行時圖片對其有兩種方式，一種軟件自動識別圖片進行對齊，另外一種就是先用 Loupe 軟件手動對齊，生成對于 json 文件提供給后面的軟件，后期會介紹怎么來手動調整圖片。

自動對齊

手動對齊

參數說明：

--Id：結果輸出文件夾名稱

--Transcriptome：基因組目錄

--Fastqs：fastq 文件木蘭路

--Sample：原始樣本名

--Image：鏡像圖片文件

--Slide：使用的 10x 芯片型號

--area：樣本所在芯片的區域（四通道芯片位置從上到下分別為 A1、B1、C1、D1）

--loupe-alignmen: 圖片手動對齊生成的 json 文件，如果是自動對齊不要需要此參數

另外，spaceranger 默認使用系統上可用的所有內核來執行管。可以使用 --localcores 選項來限制使用內核的數量。同理，可以使用 -localmem 來限制使用內存的大小。

結果輸出：

成功運行后會到的下面的信息（包括主要的輸出文件）