研究背景

牛奶是日常不可缺少的高營養動物蛋白產品，全球人均奶年消費量超過 100 公斤 / 年。許多因素都會影響奶牛的牛奶產量和質量，包括遺傳，管理和飼料喂養方式，據廣泛報道牛奶產量通常與牛奶蛋白質含量呈負相關。然而，根據研究者的發現，在相同的飲食和管理條件下飼養的奶牛，一些奶牛可以同時產生高產奶量和高乳蛋白含量的牛奶（MPY)。這是一個潛在的新性狀，乳制品生產商可能可以利用潛在的特性提高優質牛奶的產量。目前還不清楚瘤胃微生物及其代謝產物以及宿主代謝在多大程度上對 MPY 有貢獻。在此，研究者通過瘤胃代謝組學和代謝組學的分析，結合血清代謝組學，從瘤胃微生物組和宿主水平確定了 MPY 潛在的調控機制。

實驗方法

檢測方法：宏基因組測序 + 代謝組

實驗儀器：Illumina Hiseq 3000(PE150)+ GC-TOF-MS

樣本分組：HH(高 MPY) 組 =10 例，LL(低 MPY) 組 = 10 例

有 4 個樣品（HH 樣品 3 個，LL 樣品 1 個）因提取 DNA 含量低而放棄

主要結果

瘤胃宏基因組分析

通過數據比對發現瘤胃宏基因組包括 94.43%  的細菌、3.80%  的真核生物、1.41%  的古細菌和 0.16%  的病毒。

比較了兩個 MPY 組的瘤胃微生物群，古生菌在兩組間差異顯著（P <0.01，圖 1A）。PERMANOVA 分析表明，細菌和古生菌均存在顯著差異（P <0.01）。PCoA 分析顯示兩個 MPY 組之間基于細菌（圖 1B）和古生菌（圖 1C）的分離，未發現基于真核或病毒的分離。因此，兩組動物之間瘤胃微生物分類群的下游比較僅集中于細菌和古生菌。

圖 1   HH 和 LL 奶牛的微生物組成特征

HH 與 LL 奶牛瘤胃微生物群落組成特征及分類學差異

在細菌門水平的差異豐度比較分析中，LL 奶牛的瘤胃中擬桿菌門的豐度明顯更高，而 HH 奶牛的瘤胃中，變形桿菌門的含量顯著更高（調整后 P <0.05)。在種的水平上，15 個種在 HH 動物瘤胃中的豐度顯著高于 LL 動物（LDA>2，P<0.05)，23 種未分類擬桿菌在 LL 動物瘤胃中顯著富集（LDA>2，P<0.05；圖 2A)。

在古菌的差異豐度比較分析中，LL 牛瘤胃中豐富的廣古菌門的豐度顯著高于 LL 牛（P<0.01)。在屬的水平上，LL 牛瘤胃中古細菌屬甲烷短桿菌的豐度顯著高于 HH 牛（P<0.01)；在種的水平上，LL 牛瘤胃中 Methanobrevibacter millerae 豐度顯著高于 HH 牛  (LDA>2，P<0.05；圖 2B)。

圖 2   HH 和 LL 牛瘤胃細菌和古生菌種的差異

HH 和  LL  奶牛瘤胃微生物群功能特征及其差異性研究

在  KEGG  分析中，158 條內源性三級通路被認為是瘤胃微生物代謝通路。這些通路屬于 4 個一級類別，包括“代謝”（72.26±0.46%)、“遺傳信息處理”（19.08±0.12%)、“環境信息處理”（4.42±0.03%) 和“細胞過程”（4.24±0.04%)。在二級類別中，共觀察到 20 種類別，其中“碳水化合物代謝”（17.33±0.10%)、“氨基酸代謝”（15.96±0.11%)、“核苷酸代謝”（9.82±0.06%)、“復制與修復”（8.71±0.06%)、“能量代謝”（8.07±0.05%) 較為豐富。

比較已鑒定的 KEGG 通路時發現 HH 奶牛瘤胃微生物群顯著富集的有 13 條三級通路，其中 2 條是“細胞過程”通路，2 條是“遺傳信息處理”通路，2 條是“環境信息處理”通路，7 條是“代謝”通路。而 18 條通路（包括 1 條“遺傳信息處理途徑”、2 條“細胞過程途徑”和 15 條“代謝途徑”）在 LL 動物的瘤胃中顯著富集（LDA>2 和 P <0.05；圖 3A)。當比較上述不同的三級通路中涉及的 KEGG 模塊時，發現了 24 個 HH 富集的模塊和 19 個 LL 富集的模塊（圖 3B）。

圖 3   HH 和 LL 牛 KEGG 功能的差異

關于碳水化合物代謝和能量代謝，只有兩種下游功能（Ko00290 和 M00019，將丙酮酸轉化為纈氨酸和異亮氨酸）在 HH 奶牛的瘤胃中富集（圖 4A)。4 條通路和 2 個模塊在 LL 動物瘤胃中顯著富集（LDA>2，P<0.05)。這 4 條通路包括“糖酵解”（Ko00010)、“淀粉和蔗糖代謝”（Ko00500)、“半乳糖代謝”（Ko00052) 和“甲烷代謝”（Ko00680)。這 2 個模塊是“糖酵解”（M00001) 和“半乳糖降解”（M00632)。“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”（Ko00280) 的下游功能也在 LL 牛的瘤胃中富集（圖 4B)。

圖 4  HH 和 LL 奶牛瘤胃碳水化合物代謝和能量代謝的微生物功能和種類

CAZyme 研究中，共鑒定出 313 個編碼 CAZymes 的基因，包括 8 個輔助活性（AAs），79 個碳水化合物結合模塊（CBMs），16 個碳水化合物酯酶（CEs），115 個糖苷水解酶（GHs），74 個糖基轉移酶（GTs）和 21 種多糖裂解酶（PLs）。其中編碼 GT2（8.64±0.04%）的基因占主要，其次是編碼 CE1（4.66±0.02%），GT4（4.34±0.02%），GH2（4.30±0.02%）和 GH3（4.16± 0.02%）的基因。

在涉及解構碳水化合物（包括纖維素，半纖維素，淀粉，蛋白質和木質素）編碼 CAZymes 的基因中，18 種在 HH 奶牛的瘤胃中富集（15 GH、1 CE、1 PL 和 1  AA），而 34 種在 LL 奶牛的瘤胃中富集（27 GH、4 CE、2 PL 和 1  AA）。

在 GTs（涉及碳水化合物的合成）中，有 11 種在 HH 奶牛的瘤胃中富集，而有 2 種富在 LL 奶牛的瘤胃里富集。

關于 CBMs，涉及復雜碳水化合物降解相關的非催化型酶，在 HH 牛的瘤胃中富含 3 種，而在 LL 牛的瘤胃中富含 19 種。

微生物種類與功能的關系

由于蛋白質含量是 MPY 的決定性指標之一，因此研究者更多的關注在瘤胃微生物組中氨基酸代謝的功能。研究發現涉及支鏈氨基酸（BCAA）代謝的 2 個重要通路（圖 5A）：“纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成”（ko00290）和“纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解”（ko00280）。對這 2 條通路的編碼酶基因豐度進行了比較，結果表明，HH 牛瘤胃中參與支鏈氨基酸生物合成的編碼酶基因豐度均顯著高于 LL 牛（P<0.05)，而參與支鏈氨基酸降解的編碼酶基因豐度在 LL 牛瘤胃中均顯著升高（P<0.05)。

細菌種類與這兩條支鏈氨基酸通路之間的 Spearman 相關性網絡的建立，以探討瘤胃細菌種類對微生物支鏈氨基酸功能的影響。共有 24 個種與 2 條支鏈氨基酸途徑有顯著的相關性（R>0.50,P<0.05)，13 個種與支鏈氨基酸生物合成途徑（Ko00290) 呈正相關。在 13 個菌種與 Ko00290 之間的正相關中，較強的是包括 P.multisaccharivorax, P. histicola, P. maculosa, P. buccae,  以及  P. albensis  在內的 5 種普氏桿菌屬（圖 5B)。

圖 5A  支鏈氨基酸的生物合成和降解途徑

圖 5B  顯著不同的菌種與 2 條支鏈氨基酸途徑之間存在關聯的相關網絡圖

代謝組分析

在瘤胃代謝物中共鑒定出 263 種化合物。對瘤胃代謝物的相對濃度進行 t 檢驗和 VIP 篩選后，25 種代謝物在兩個 MPY 組間差異顯著（P<0.05，VIP>1；圖 6A)，HH 牛瘤胃中 25 種代謝物的相對濃度顯著高于 LL 組（P<0.05，VIP>1；圖 6A)。基于這 25 種顯著不同瘤胃代謝產物的代謝通路分析（MetPA) 顯示，有 10 條通路富集（圖 6B)，其中“維生素 B6 代謝”、“甘油脂代謝”和“β- 丙氨酸代謝”是顯著不同的通路（FDR<0.01,pathway impact>0.1)。

瘤胃代謝組還用于表型（MPY) 關聯分析，檢測到 126 個與 MPY 相關的代謝型。126 個 MPY 代謝型用于 PERMANOVA 分析，其中 106 個 MPY 代謝型（均為 MPY 陽性代謝型）與瘤胃菌群變化相關（P<0.05)。這 106 個 MPY 陽性代謝型被認為是瘤胃微生物組響應的代謝型，然后發現它們與 43 個微生物模塊顯著相關（P<0.05)。除了代謝組學鑒定的瘤胃小分子的相對濃度外，還量化了總揮發性脂肪酸（VFAS)、丙酸、戊酸和異戊酸的 JUé對濃度（圖 6C,D)，并在 HH 奶牛中得到了顯著的提高（P<0.05)。

圖 6  HH 牛和 LL 牛的瘤胃代謝組

對于血清代謝組，研究者分析了先前研究中鑒定的 176 種化合物。比較分析表明，HH 奶牛血清中 19 種代謝物的相對濃度明顯更高（P<0.05)，LL 奶牛血清中 12 種代謝物的相對濃度顯著升高（P<0.05，VIP>1；圖 7A)。

將上述 31 種不同濃度的代謝物用于 MetPA 分析，揭示了 12 條通路的富集（圖 7B)，其中“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”、“煙酸和煙酰胺代謝”、“鞘脂代謝”、“氨基酰 tRNA 生物合成”和“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”是顯著不同的通路（FDR <0.01, pathway impact>0.1）。

圖 7   HH 和 LL 牛的血清代謝組

將血清代謝組用于表型（MPY) 關聯分析，將血清代謝物鑒定為 MPY 陽性代謝型（21 種代謝物）或 MPY 陰性代謝型（14 種代謝物）。

為了確定瘤胃和血清中的 MPY 相關代謝物是否相關，研究者比較了瘤胃和血清中的代謝物，包括兩個 MPY  組之間顯著差異的代謝物、MPY 陽性代謝型和 MPY  陰性代謝型等。差異代謝物的 Venn 圖顯示，月桂酸的脂肪酸是瘤胃和血清共有的（圖 8A）。對于差異代謝通路，HH  奶牛瘤胃和血清中的“嘧啶代謝”、“甘油脂代謝”和“淀粉和蔗糖代謝”三個途徑是共有的（圖 8B）。MPY 相關代謝型的  Venn 圖顯示，“精氨酸和脯氨酸代謝”、“氨基酰基轉移酶合成”和“嘌呤代謝”是瘤胃和血清 MPY  陽性代謝型共有的（圖 8C）。

圖 8A  Venn 圖顯示不同 MPY 組之間瘤胃和血清中的代謝物存在顯著差異。

圖 8B  Venn 圖顯示關鍵通路（基于顯著差異的代謝物而富集）

圖 8C  Venn 圖顯示瘤胃和血清中存在  MPY  陽性和  MPY 陰性代謝產物熱圖顯示每個樣本中每個代謝物集的  Z  分數轉換豐度

瘤胃微生物組，瘤胃代謝組和血清代謝組之間的關系及其對 MPY 的解釋性

瘤胃微生物群與瘤胃代謝產物之間的 spearman 相關性分析：結果顯示有 65 個顯著相關（R>0.50，P<0.05；圖 9A)。在 65 種相關性中，主要 11 個種普氏菌種與氨基酸、多肽、蛋白質、有機化學物質呈正相關（0.50

瘤胃微生物群和血清代謝物之間的 Spearman 相關性分析（圖 9B)：與瘤胃微生物群和瘤胃代謝產物之間確定的關系相比，存在的關系較少。瘤胃微生物群與血清 MPY 相關的代謝型之間的關系表明，7 個普氏菌種參與幾種氨基酸代謝的代謝型呈正相關，這些氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸（圖 9D）。

圖 9    瘤胃代謝組、代謝組和血清代謝組之間的相互作用

利用線性混合效應模型進一步分析了瘤胃微生物組成、功能、代謝產物和血清代謝產物對宿主  MPY  的貢獻率分別為 17.81%、21.56%、29.76%  和 26.78%（圖 10）。

圖 10  本研究流程圖

結論

這些發現為在相同管理條件下微生物組依賴性和寄主依賴性機制如何促進奶牛產奶質量的不同個性化表現提供了基本理解。這些基本信息對于開發通過高精度喂養提高牛奶質量和產量的潛在操作策略至關重要。

參考文獻：Ming-Yuan Xue, Hui-Zeng Sun, Xue-Hui Wu, et al. Multi-omics reveals that the rumen microbiome and its metabolome together with the host metabolome contribute to individualized dairy cow performance. Microbiome.2020; 12;8(1):64