檢測(cè)方法：靶向代謝組檢測(cè)

檢測(cè)平臺(tái)：CE-MS

樣本分組：分為 3 組，分別為 AD 組（n=17）、ASY 組（n=13）、CN 組（n=13）

2. 通過 GEO datasheet【內(nèi)嗅皮層（ERC) 區(qū)：AD 組 =25,CN 組 = 52; 海馬（HIP) 區(qū)：AD 組 =29,CN 組 =56】驗(yàn)證通路中調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)的變化情況。

表 1 CE-TOFMS 檢測(cè)的局部腦組織代謝物濃度（pmol/mg)

研究者采用 R -Studio1.1.453 和 STATA16.0 軟件進(jìn)行分析。使用 α 值 0.05 來確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)進(jìn)行了多重比較方法 Benjamini-Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR=0.05）和 bonferoni 校正（FWER=0.05）。兩種比較方法均校正了 52 種比較（26 種代謝物×2 個(gè)主要腦部區(qū)域 ITG 和 MFG），這些比較是基于它們對(duì)不同 AD 病理的易感性而預(yù)先指定的。檢查了三組（AD，ASY 和 CN）在性別，APOEε4 攜帶者狀態(tài)（Fisherexact 試驗(yàn)），年齡和驗(yàn)尸間隔（PMI）（Kruskal-Wallis 測(cè)試）方面的差異樣。信息如表 2：

表 2  BLSA 尸檢樣本的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征

本研究的主要分析不同組之間代謝物水平的差異，研究者在兩個(gè)主要大腦區(qū)域 ITG,MFG 以及次級(jí)控制區(qū)域 CB 中的預(yù)先定義代謝物類別用線性混合效應(yīng)模型，其中以 log2 轉(zhuǎn)換濃度作為因變量，組作為固定效應(yīng)，非結(jié)構(gòu)化的組內(nèi)殘差相關(guān)性，Huber-White 穩(wěn)健方差估計(jì)，然后使用的相同的方法，僅針對(duì)主要大腦區(qū)域（即 ITG 和 MFG），分析腦組織代謝物與 Braak 和 CERAD 病理評(píng)分的相關(guān)性。利用廣義估計(jì)方程（GEE）聚類分析和獨(dú)立 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)的非參數(shù) Spearman 相關(guān)進(jìn)行敏感性分析，得到了相似的結(jié)果（圖 1 -3）。

圖 1 為可視化代謝物變化方向和影響大小的森林圖。表明不同組之間的顯著代謝物濃度差異。圖 2 顯示了代謝物濃度和神經(jīng)斑塊負(fù)荷（即 CERAD 評(píng)分）之間的關(guān)聯(lián)。圖 3 顯示了代謝物濃度和神經(jīng)原纖維病理學(xué)（即 Braak 評(píng)分）之間的關(guān)聯(lián)。圖 1 - 3 中綠色表示 AD 中代謝物濃度較低，與 AD 病理呈負(fù)相關(guān)；紅色表示表示 AD 中代謝物濃度較高，與 AD 病理呈正相關(guān)。

圖 1 類別特異性代謝物濃度的組間差異

圖 2 類別特異性代謝物與神經(jīng)癥性斑塊負(fù)荷（CERAD) 的關(guān)聯(lián)

圖 3 特定類別代謝物與神經(jīng)原纖維病理學(xué)（Braak）之間的關(guān)聯(lián)

基因表達(dá)分析

表 2 列出了在三個(gè) GEO 數(shù)據(jù)集中有基因表達(dá)數(shù)據(jù)的參與者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征。在 GEO 數(shù)據(jù)中，AD 參與者明顯比 CN 參與者年齡大（p<0.05)。BLSA 參與者和 GEO 參與者沒有性別差異；BLSA 參與者明顯比 GEO 參與者年齡大（p<0.05)。

表 3 來自 GEO 數(shù)據(jù)的參與者人口統(tǒng)計(jì)

對(duì)于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，首先使用 Robust Multi-array Average(RMA) 和 Brainarray ENTREZG（version 22）自定義 CDF 對(duì)樣本進(jìn)行歸一化。利用 GEO 數(shù)據(jù)集 GSE48350、GSE5281 和 GSE8442，并使用 GEO 數(shù)據(jù)集名稱對(duì)所有的批次協(xié)變量進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。然后使用 one-way ANOVA test 測(cè)試 AD 和 CN 樣本在性別、年齡和批次上的差異。利用 R 包 limma 檢測(cè) AD 和 CN 樣本之間的單個(gè)基因的單變量差異，控制性別、年齡和批次的影響，并使用 FDR(p=0.05) 調(diào)整 GEO 數(shù)據(jù)集中使用的 Affymetrix U133 Plus 2.0 數(shù)組中的所有的 20414 個(gè)基因的多重比較。總結(jié)了性別、年齡和成批校正的倍數(shù)變化結(jié)果。

為了確認(rèn) ERC 和 HIP 中的區(qū)域基因表達(dá)與進(jìn)行代謝組學(xué)測(cè)定的 ITG 和 MFG 中的基因表達(dá)相關(guān)性，研究者檢測(cè)了在顳下和中額葉皮層中檢測(cè)的 71 個(gè)基因中的區(qū)域基因表達(dá)變化，ITG 中的區(qū)域基因表達(dá)與 HIP 區(qū)（p=0.455,p=5.9×10-5) 和 ERC(p=0.260,p=0.0276) 顯著相關(guān)，MFG 中的區(qū)域基因表達(dá)也顯著相關(guān)（HIP 區(qū) p =0.512，p=4.19×10-6;ERC 區(qū)：p=0.344,p=0.0031）。

甲基化和多胺途徑相關(guān)的生化反應(yīng)的六個(gè)類別中的 33 個(gè)基因（FDR 校正的 p 值 <0.05）中，AD 和 CN 的 ERC /HIP 區(qū)域的基因表達(dá)水平發(fā)生了變化。使用 FDR 校正多次后，AD 和 CN 樣品之間基因表達(dá)的這些差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與 CN 相比，圖 4 總結(jié)了 AD 患者的 HIP/ERC 中與轉(zhuǎn)甲基化和多胺代謝相關(guān)的所有六類生化反應(yīng)的差異表達(dá)基因。灰色表示 AD 患者和對(duì)照組的基因表達(dá)沒有顯著差異。

圖 4   ERC 和海馬區(qū)差異基因表達(dá)熱圖

特定代謝途徑中代謝物濃度和基因表達(dá)變化

本研究者先前的研究表明了 AD 中的糖酵解、脂肪酸和磷脂代謝的異常，本研究則發(fā)現(xiàn)了研究了轉(zhuǎn)甲基化途徑（一碳單位的主要代謝來源）和密切相關(guān)的多胺合成 / 分解代謝途徑的失調(diào)與 AD 的發(fā)病相關(guān)。包括神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)、尿素循環(huán)、天冬氨酸類谷氨酸代謝和谷胱甘肽合成的異常。（研究者將 ITG 組差異的主要結(jié)果在特定的生化途徑中）

1. 蛋氨酸循環(huán)  ITG 中 AD 組膽堿濃度較低（p=0.003)，SAM 濃度較高（p=0.005)。與 CN 相比，AD 海馬 /ERC 中 CHDH、BHMT2、SHMT1 和 MAT1A 基因表達(dá)增加，MTR、AHCY 和 MTHFD1 基因表達(dá)降低。

2. 轉(zhuǎn)硫法與谷胱甘肽合成   ITG 的 AD 患者半胱氨酸（P<0.001*) 和谷胱甘肽濃度（P<0.001*) 較高。與 CN 相比，AD 組海馬 /ERC 中轉(zhuǎn)硫和谷胱甘肽合成的酶調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)存在差異。與 CN 相比，AD 組海馬 /ERC 區(qū) CTH 和 GSS 基因表達(dá)降低。

3. 多胺的合成與分解代謝在  ITG 中的 AD 中觀察到較高濃度的亞精胺（P=0.004)。與 CN 相比，多胺分解代謝基因 SAT1 和 SMOX 表達(dá)增加，而多胺合成基因 SRM 和 ODC1 在海馬 / ERC 中表達(dá)降低。

4. 尿素循環(huán)   在 ITG 中，AD 中的 NAG(P<0.001*) 濃度較低。與 CN 相比，基因 ARG2，ASL，ASS1，OAT 和 ODC1 在 AD 的海馬 / ERC 中表達(dá)減少。

5. 谷氨酸 - 天冬氨酸代謝    在 ITG 中，AD 中的 NAA (P=0.002*) 濃度較低。與 CN 相比，AD 的 FH，MDH1，MDH2，GLS2 和 GOT2 基因在海馬 / ERC 中的表達(dá)降低。

6. 神經(jīng)遞質(zhì)代謝   ITG 中，AD 中的 GABA(P<0.001*) 濃度較低。與 CN 相比，AD 中海馬 / ERC 中 GABA 合成基因 SAT1 和 MAOB 的表達(dá)增加，而 GLS2 和 OAT 基因的表達(dá)降低。

圖 5 通過整合了六類生化反應(yīng)的代謝物和基因表達(dá)結(jié)果，顯示了這些途徑如何在多個(gè)水平上交叉和潛在地相互作用，以影響 AD 病理和癥狀的嚴(yán)重程度。

圖 5 與轉(zhuǎn)甲基化和多胺合成 / 分解代謝相關(guān)的代謝途徑中代謝物濃度和基因表達(dá)變化的綜合總結(jié)

總結(jié)與局限性

本研究是利用 CE-MS 在腦組織樣本中應(yīng)用靶向代謝組學(xué)結(jié)合基因表達(dá)分析來識(shí)別與 AD 的轉(zhuǎn)甲基化和多胺途徑相關(guān)的多個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的異常的研究。由于 ERC 和 HIP 組織樣本的可獲得性有限，代謝組學(xué)分析只能在基因表達(dá)與 ERC 和 HIP 相關(guān)的 ITG、MFG 和 CB 中進(jìn)行的，具有一定的局限性，但是，結(jié)合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析來繪制先驗(yàn)特定的生化途徑，可能會(huì)為 AD 如何廣泛影響多條相互關(guān)聯(lián)的代謝途徑提供重要的見解。雖然樣本量較少，研究可能無法將結(jié)果外推到更大的人群，顯著的結(jié)果可能不能反映真正的效果，所以研究者用感興趣的代謝物指定了先驗(yàn)假設(shè)，并實(shí)施了 FDR 和 Bonferroni 調(diào)整來控制多重比較，以減少潛在的偏差，值得考慮的是，在基于尸檢的神經(jīng)退行性疾病（如 AD) 的評(píng)估中，一些觀察到的變化可能是與神經(jīng)元丟失相關(guān)的終末事件的非特異性標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)的特異性值得在未來的研究中在其他神經(jīng)退行性疾病中進(jìn)行測(cè)試。細(xì)胞甲基化潛在的改變和轉(zhuǎn)甲基化途徑通量的增加，對(duì)抗氧化防御機(jī)制的需求增加，尿素循環(huán)和天冬氨酸 - 谷氨酸途徑的代謝紊亂，擾亂了線粒體生物能，增加了多胺的生物合成和分解，以及神經(jīng)遞質(zhì)代謝的異常，這與 AD 的病理嚴(yán)重程度和臨床癥狀的表現(xiàn)有關(guān)。它們說明了 AD 的輪廓是一種普遍存在的代謝紊亂，可能涉及多條相互關(guān)聯(lián)的代謝途徑的失調(diào)，每條代謝途徑都能夠觸發(fā) AD 病理的積累和癥狀的演變。這項(xiàng)研究大大增加了對(duì) AD 發(fā)病的代謝基礎(chǔ)的全面理解，并為疾病調(diào)整治療的新靶點(diǎn)提供了新視角。

參考文獻(xiàn) Uma V. Mahajan, Vijay R. Varma,et al. Dysregulation of multiple metabolic networks related to brain transmethylation and polyamine pathways in Alzheimer disease: A targeted metabolomic and transcriptomic study. PLoS Med.2020; 17(1):e1003012. Epub2020/01/14

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003012  PMID: 31978055