導語
組織駐留巨噬細胞（TRM）和樹突狀細胞（DC）具有高度異質性，對免疫、組織再生和穩態維持至關重要。本文通過單細胞 RNA 測序全面分析了成年斑馬魚器官中 TRM 和 DC 的異質性。鑒定了兩個巨噬細胞亞群：在屏障組織、肝臟和心臟中具有組織再生特征的促炎性巨噬細胞和具有組織再生特征的促炎性巨噬細胞。同時，在這些器官中還觀察到一種具有突出抗原呈遞能力的常規樹突狀細胞（cDC）群體和具有抗病毒特性的漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）。值得注意的是，除了具有強大吞噬能力的單個巨噬細胞 / 小膠質細胞群外，在大腦中還鑒定出一個 pDC 細胞群和兩個不同的 cDC 群。本研究描繪了 TRM 和 DC 的景觀，并為深入研究斑馬魚中的這些細胞創造了有價值的工具。
技術方法
ScRNA-Seq
研究結果
1. scRNA-seq 揭示了成年斑馬魚中不同的 mpeg1.1+ 免疫細胞類型
從 6 個月大的 Tg（mpeg1.1:DsRedx）魚的六個不同器官（包括三個屏障組織（表皮、鰓、腸）和三個內臟（肝臟、心臟和大腦）中分離出來的 mpeg1.1+ 細胞（一種被廣泛使用的髓系報告細胞系）進行了基于液滴的 scRNA-seq（圖 1A）。在嚴格的質量控制過濾和進一步排除受污染的 mpeg1.1- 細胞后，研究者分別對每個器官中的高質量 mpeg1.1+ 細胞進行無監督聚類，研究的 scRNA-seq 數據顯示，Tg（mpeg1.1:DsRedx）報告基因標記了八個不同的細胞群，包括三個單核髓細胞群（巨噬細胞、DC 和中性細胞）、兩種淋巴細胞類型（B 和 NK 樣 [NKL]）和一個 il6r+ 群，以及翻譯和循環簇。由于翻譯和循環簇可能代表巨噬細胞和樹突狀細胞的特定發育階段或功能狀態，研究者在此專門關注其他六個細胞群。
2. mpeg1.1+ 免疫細胞群在器官中高度保守
通過組合來自所有器官的 mpeg1.1+ 群進行比較分析，評估了同一細胞群在不同器官之間的轉錄相似性。Pearson 相關分析顯示，來自不同器官的相同細胞群通常高度相關（圖 2A）。這些群體的總體跨器官相似性表明，每個細胞群都有一個核心轉錄組特征，該特征定義了其身份，并賦予了跨器官的特殊功能，并揭示了可能參與其發育的譜系特異性 TFs。
3. 屏障組織、肝臟和心臟中兩種不同功能的巨噬細胞亞群
從所有器官中提取了巨噬細胞群體，并以更高的分辨率重新聚集（圖 3A）。由于腦內的巨噬細胞——小膠質細胞，與屏障組織、肝臟和心臟中的巨噬細胞表現出相對不同的轉錄組特征（圖 2A），分別討論了外周巨噬細胞和小膠質細胞。聚類顯示了兩種不同的巨噬細胞亞群，lgals3bpb+ 巨噬細胞和 ccl34a.4+ 巨噬細胞，在屏障組織、肝臟和心臟中具有不同的分布模式（圖 3A–3C），對這兩個吞噬細胞亞群之間的 DEGs 進行了基因本體（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果顯示 lgals3bpb+ 巨噬細胞表現出促炎作用，具有較強的吞噬作用和免疫細胞募集能力。另一方面，ccl34a.4+ 巨噬細胞最突出的特征是它們廣泛表達與組織重塑和再生有關的基因，包括與細胞生長和增殖（例如 igf2b 和 hBegfa）、細胞外間質重塑（例如 timp2b、timp4.3 和 tgfbi）、傷口愈合（例如 plecb 和 f13a1b）和免疫調節（例如 cfp、ccl34a.4 和 ccl38.1）（圖 3D 和 3F）
4. 斑馬魚中的 cDCs 和 pDCs
為了更好地了解斑馬魚 DCs 的異質性、分布、個體發育和功能，作者從每個器官中提取了 DC 群體，并重新進行了聚類分析。與哺乳動物一樣，斑馬魚包含兩個主要的 DC 群：具有與抗原呈遞相關基因的 cDCs（例如 mhc2dab、cd74a）和基于其內源性 TLRs 的獨特表達而定義的 pDCs（tlr7.1 和 tlr9）在屏障組織、肝臟和心臟中，檢測到一個主要的 cDC 群，斑馬魚 cDCs 可能作為抗原呈遞細胞發揮作用，并可能發揮重要的免疫調節作用。另一方面，斑馬魚的 pDCs 顯著高表達組織蛋白酶 Bb（ctsbb）和嘌呤受體蛋白 P2X 3a（p2rx3a）（圖 4B）。除了內源性 TLRs tlr7.1 和 tlr9（圖 4D 和 S2B）的獨特表達外，哺乳動物 pDCs 的特征基因也富集于控制 I 型干擾素產生的干擾素調節因子（例如 irf3 和 irf7）（圖 4D 和 4E），表明它們在抗病毒應答中的專門作用，這是哺乳動物 pDCs 的顯著功能。與只有一個 cDC 群的屏障組織、肝臟和心臟不同，大腦具有兩個不同的轉錄 cDC 亞群，cnn3a+cDCs 和 ccl35+cDCs，各類富集分析表明，成年斑馬魚大腦中含有吞噬小膠質細胞和調節性 DCs，它們具有深刻的腦特異性特征，并在中樞神經系統中發揮特殊功能。
5. 為巨噬細胞和 DC 亞群生成特異性報告細胞系
通過鑒定成年斑馬魚中不同的巨噬細胞和 DC 亞群，接下來試圖產生特定的報告細胞系，用于這些細胞發育和功能的進一步研究。選擇兩個分別在器官和所有 TRMs 的 cDC 群中高表達的基因 ccl35.1 和 c1qb 作為常見的 cDC 和泛巨噬細胞標記。此外，選擇分別在促炎性巨噬細胞和促重塑巨噬細胞中明確表達的 lgals3bpb 和 ccl34a.4 作為巨噬細胞子集特異性標記。基于這些基因的熒光報告系是通過克隆其啟動子或利用其細菌人工染色體（BAC）載體來創建的。結果，獲得了四個報告系，TgBAC（ccl35.1:EGFP）、Tg（c1qb:EGFP）、Tg（lgals3bpb:EGFP）和 TgBAC（ccl34a.4:EGFP），其可能分別標記常見的 cDCs、泛巨噬細胞、促炎巨噬細胞和促重塑巨噬細胞（圖 6A-6D）。這些報告基因系忠實地再現了標記基因的內源性表達，并特異性標記了指定的巨噬細胞或 DC 亞群，為研究這些不同髓系群的發育和功能提供了有力的工具。
總結
在這項研究中，作者利用 scRNA-seq 來破譯成年斑馬魚中 TRM 和 DC 的異質性，在器官中鑒定了各種功能保守的 TRM 和 DC 亞群，并根據這些不同亞群的區分標記生成了幾種巨噬細胞和 DC 特異性報告系。該研究增強了對斑馬魚中 TRM 和 DC 的理解，并為這些細胞的進一步發育和功能表征提供了有價值的工具。
參考文獻：
Zhou Q, Zhao C, Yang Z, Qu R, Li Y, Fan Y, Tang J, Xie T, Wen Z. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112793. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112793. Epub 2023 Jul 14. PMID: 37453064.
