福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理（FFPE, Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded）的樣品，是指經(jīng)福爾馬林（目前應(yīng)用廣泛的固定劑為 10% 中性福爾馬林）固定，石蠟包埋形成的切片或石蠟塊。
FFPE 的重要性及其特殊性
FFPE 處理是目前長期保存病理樣本的標(biāo)準(zhǔn)化方法，保存了大量的臨床上患病和正常組織的樣本資源，該樣本代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中，其中大多數(shù)是 FFPE 樣品。但是由于 FFPE 樣本通常珍貴且保存時(shí)間長，存在 RNA/DNA 量少和高度降解的問題，因此如何獲得 FFPE 樣本所蘊(yùn)藏的生物信息，如何利用分子生物學(xué)方法對 FFPE 樣本進(jìn)行檢測，進(jìn)而針對 FFPE 樣本進(jìn)行高通量組學(xué)分析就變得越來越重要。
FFPE 樣本準(zhǔn)備、儲(chǔ)存及運(yùn)輸
樣本質(zhì)量是確保下游研究應(yīng)用（微陣列芯片、新一代測序，Real-Time PCR 等）中獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。FFPE 樣本質(zhì)量與樣本固定時(shí)間，儲(chǔ)存條件與儲(chǔ)存年限等密切相關(guān)。
針對 FFPE 樣本的解決方案
表達(dá)譜研究
微陣列技術(shù)（Microarray) 也叫基因芯片，主要是指由成千上萬條寡核苷酸探針密集固定于硅片、玻片等固相支持物上，與標(biāo)記的待測樣品進(jìn)行雜交，然后由掃描儀等設(shè)備獲取圖象信息，通過計(jì)算機(jī)分析處理獲得信息的技術(shù)集合，是許多復(fù)雜核酸樣本中特定 DNA 序列定性和 RNA 相對定量研究的有效工具。基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于基因作圖、變異分析和基因表達(dá)的檢測，并且有希望成為科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)工具。
上海伯豪生物技術(shù)有限公司作為國內(nèi)從事基因芯片服務(wù)的團(tuán)隊(duì)，具有多年的研發(fā)和服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，已建立了 SBC 點(diǎn)制芯片、Affymetrix 芯片、Agilent 芯片、Illumina 芯片等微陣列技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，為國內(nèi)外數(shù)千家科研單位和企業(yè)提供技術(shù)服務(wù)和支持。
適用于 FFPE 樣本的芯片類型
產(chǎn)品介紹： 此款芯片包含了 47,000 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表了 38,500 個(gè)明晰的人類基因。數(shù)據(jù)庫來源于 GeneBank、dbEST、RefSeq、UniGene database (Build 159 January 25 2003)、Washington University EST trace repository、NCBI human genome assembly (Build 31)。
案例
非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種由于代謝紊亂引起的肝炎，也是肝癌（NASH-HCC）發(fā)生的重要來源之一。但是，對于 NAFFLD 如何向 NASH-HCC 發(fā)展的分子機(jī)制還不了解。來自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員，通過石蠟包埋樣本的檢測與后續(xù)功能驗(yàn)證，找到了一個(gè)肥胖相關(guān)基因，KIAA1462（JCAD），在由 NAFLD 向 NASH-HCC 發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用，為尋找 NASH-HCC 生物標(biāo)志物及分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。該研究成果發(fā)表在腫瘤研究領(lǐng)域權(quán)威期刊《Cancer Research》（IF:9.12) 上。 本研究 Affymetrix GeneChip? Human Genome U133 Plus 2.0 Array 由上海伯豪提供實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。
研究思路
研究人員首先通過 4 例 NASH-HCC 的 FFPE 樣本的表達(dá)譜芯片檢測，發(fā)現(xiàn) JCAD 在癌組織中高表達(dá)。多種肝癌細(xì)胞系驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn) JCAD 高表達(dá)。過表達(dá)和敲降 JCAD 實(shí)驗(yàn)表明腫瘤生長和增殖受到影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，JCAD 與腫瘤抑制激酶 LATS2 互作，影響 YAP 的磷酸化，進(jìn)而上調(diào) CCND1 和 GLI2，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。此外，在小鼠模型中，JCAD 受脂肪酸過載誘導(dǎo)高表達(dá)，YAP 的磷酸化降低；在人的 NASH-HCC 組織中，JCAD 表達(dá)與 YAP 磷酸化與模型結(jié)果一致。該研究為理解 HASH 向 HCC 轉(zhuǎn)化過程中，JCAD 的重要作用提供了依據(jù)，也為治療提供了潛在靶點(diǎn)。
JCAD 在腫瘤組織中高表達(dá)。A，差異 mRNA 的 GO 分析結(jié)果；B，差異 mRNA 熱圖；C，mRNA 差異倍數(shù)柱形圖。
參考文獻(xiàn)
Ye J , Li TS , Xu G, Zhao YM, Zhang NP, Fan J, Wu J. JCAD Promotes Progression of Nonalcoholic Steatohepatitis to Liver Cancer by Inhibiting LATS2 Kinase Activity. Cancer Res.2017.
服務(wù)產(chǎn)品：Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0
產(chǎn)品介紹： 高分辨率的基因芯片，支持所有轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的全轉(zhuǎn)錄組分析，包含超過六百萬條不同探針，覆蓋編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本。該芯片為每個(gè)外顯子設(shè)計(jì)約 10 條探針，每個(gè)外顯子之間的剪接點(diǎn)有 4 條探針，確保每個(gè)實(shí)驗(yàn)都能獲得完整、準(zhǔn)確和可重復(fù)的數(shù)據(jù)。重復(fù)性高（批內(nèi)相關(guān)系數(shù)≥0.99），所有檢測過的組織觀察到的變異系數(shù)（CV）<6.5%。
服務(wù)產(chǎn)品：Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0ST Array
產(chǎn)品介紹：Affymetrix 新一代全轉(zhuǎn)錄本芯片，在一張芯片上可以同時(shí)檢測 mRNA 和 lincRNA，在其上一代 1.0 ST Array 的基礎(chǔ)上，該芯片內(nèi)容進(jìn)一步豐富并更新數(shù)據(jù)庫。2.0 ST Array 有更多的優(yōu)點(diǎn)：全面覆蓋轉(zhuǎn)錄組，可以同時(shí)檢測 >30,000 個(gè)編碼的轉(zhuǎn)錄本和 >11,000 個(gè)長鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本；探針設(shè)計(jì)大程度覆蓋所有外顯子，可檢測選擇性拼接 / 轉(zhuǎn)錄本變體。每個(gè)轉(zhuǎn)錄本覆蓋特異探針的數(shù)目中值達(dá)到 21 種，每種探針的長度為 25bp，這意味著每個(gè)轉(zhuǎn)錄本將被檢測的堿基數(shù)中值高達(dá) 525 個(gè)；重復(fù)性高；靈敏度高。
案例
鼻咽癌是我國常見的頭頸腫瘤，其中以華南地區(qū)較多。約 70% 的鼻咽癌患者在就診時(shí)已經(jīng)處于局部區(qū)域晚期（無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移），嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康。中山大學(xué)腫瘤防治中心馬駿教授團(tuán)隊(duì)開展了現(xiàn)今國際大規(guī)模的鼻咽癌分子標(biāo)志物研究，團(tuán)隊(duì)通過表達(dá)譜芯片（A?ymetrix Human Gene 2.0 ST microarray）對接受治療后有無出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織全基因組表達(dá)水平進(jìn)行對比分析，從數(shù)萬個(gè)基因中初步鎖定 137 個(gè)差異表達(dá)基因，再用回歸分類器的統(tǒng)計(jì)方法從 410 例患者中篩選 13 個(gè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因構(gòu)建分子標(biāo)簽，將病人分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者 5 年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá) 37%，低風(fēng)險(xiǎn)組則僅為 9%。研究團(tuán)隊(duì)采用 ROC 對指標(biāo)的敏感性和特異性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)單純臨床 N 分期預(yù)測遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性僅為 57%；將分子標(biāo)簽與 N 分期等臨床指標(biāo)相結(jié)合構(gòu)建鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移線列圖，則能夠?qū)㈩A(yù)測準(zhǔn)確性由 57% 提高至 75%（提高了 18%，）。（該項(xiàng)研究結(jié)果在佛山市第一人民醫(yī)院、桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的患者樣本中均得到了驗(yàn)證）。 本研究 A?ymetrix Human Gene 2.0 ST microarray+Ovation FFPE WTA system（NuGEN）由上海伯豪提供實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。
研究思路
13 個(gè)基因構(gòu)成的分子標(biāo)簽（DMGN）能有效預(yù)測鼻咽癌患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存
參考文獻(xiàn)：
Xin-Ran Tang, et al. Development and validation of a gene expression-based signature to predict distant metastasis in locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: a retrospective, multicentre, cohort study. Lancet Oncol. 2018 Mar;19(3):382-393.
服務(wù)產(chǎn)品：Agilent SurePrint Human miRNA Microarrays
產(chǎn)品介紹：Agilent miRNA 芯片是世界上被使用廣泛的 miRNA 芯片研究平臺(tái)，截止 2017 年 9 月為止在 NCBI GEO 數(shù)據(jù)庫中已有使用該芯片平臺(tái)的樣本數(shù)共 16605 例，比第二位的多出 7000 例。在 2014 年發(fā)表在 Nature Biotechnology 上的 miR 研究平臺(tái)綜合比較 miRQC 文章中可以得出結(jié)論：Agilent miR 芯片平臺(tái)適用于臨床樣本的研究。該平臺(tái)需要的底限總 RNA 用量僅 100ng，不需要進(jìn)行擴(kuò)增過程，能夠大程度地檢測各種 miR 的含量及表達(dá)量，不僅適用于常規(guī)組織及細(xì)胞樣本，還適用于各種臨床樣本如血清、血漿、FFPE、尿液、腦脊液等樣本。
服務(wù)產(chǎn)品：Affymetrix miRNA 4.0array
產(chǎn)品介紹： 高覆蓋度 - 涵蓋 miRBase Release 20 中所有成熟的 miRNA 序列；新型的分析 - 采用同樣的芯片可以檢測人、小鼠、大鼠或其他物種的 miRNA（同時(shí)檢測 203 個(gè)物種的 miRNA）；信息量大 - 芯片結(jié)果包括：host gene ID、miRNA target genes、clustered miRNA 等；高靈敏度：檢測豐度跨 4 個(gè) log，可以檢測到 1.0 attomol 的 microRNA 含量。
案例 1
妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病（GTD) 包括一系列的滋養(yǎng)細(xì)胞衍生疾病。其中常見的一種類型是水泡狀胎塊（HM）。一些 HMs 可進(jìn)一步發(fā)展為惡性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤。MicroRNA 的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在著重要聯(lián)系。同時(shí) miRNA 的表達(dá)情況對于疾病的診斷，發(fā)展階段，進(jìn)程及化療反應(yīng)也起著重要作用。但是到目前為止，關(guān)于 GTD 的 miRNAs 表達(dá)研究還很少。因此本研究中，來自上海交通大學(xué)的研究人員通過 miRNA 芯片（Affymetrix GeneChip miRNA 4.0）對 FFPE 樣本進(jìn)行 miRNA 表達(dá)檢測，共篩選到了 6 個(gè) miRNAs，進(jìn)一步的功能研究發(fā)現(xiàn)，該 miRNAs 與細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移，侵襲相關(guān)。其中 miRNA-371a-5p 可以通過調(diào)控其靶基因，同時(shí)調(diào)控與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路。 本研究 Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 由上海伯豪提供實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。
MiR-371a-5p 和 miR-518a-3p 在 GTN 組織和絨毛膜上皮癌細(xì)胞都上調(diào)表達(dá)。a 在組織中進(jìn)行 qRT-PCR 驗(yàn)證；b 在有絨毛的人類滋養(yǎng)層，永生化正常滋養(yǎng)細(xì)胞系 HTR-8/SVneo 及絨毛膜癌細(xì)胞系 BeWo, JAR, and JEG- 3 中驗(yàn)證 miR-37a-5p 和 miR-518a-3p 的表達(dá)；c 熒光原位雜交檢測 miR-371a-5p 和 miR-518a-3p。
參考文獻(xiàn)
Zhao J R, Cheng W W, Wang Y X, et al. Identification of microRNA signature in the progression of gestational trophoblastic disease[J]. Cell death & disease, 2018, 9(2): 94.
案例 2
L- 含羞草素可以激活 HIF-α, 進(jìn)而緩解腎小管間質(zhì)損傷，并在大鼠殘腎模型中改善腎功能。研究人員通過 miRNA 芯片（miRNA Profiling Array）對 FFPE 樣本檢測，發(fā)現(xiàn) miRNA-29c 出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，且 L - 含羞草素處理后可以恢復(fù)其表達(dá)水平。進(jìn)一步在 HK2 細(xì)胞系中也同樣發(fā)現(xiàn) miRNA-29c 的下調(diào)。而 miRNA-29c 的下調(diào)可以提高間質(zhì)纖維化以及膠原蛋白 II 型（COL2A1) 蛋白和原肌凝蛋白 1 (TPM1) 蛋白的表達(dá)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn) COL2A1 和 TPM1 可以作為 miRNA-29c 新的靶基因。作者認(rèn)為 miRNA-29c 是一個(gè)抗纖維化的 miRNA，在腎纖維化中 miRNA-29c 會(huì)出現(xiàn)下調(diào)，而在 HIF- α 激活的條件下，miRNA-29c 的表達(dá)可以恢復(fù)，并且可以緩解纖維化。 本研究所使用的 Rat miRNA microarrays (Agilent Technologies) 由上海伯豪提供實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。
L- 含羞草素可以恢復(fù)殘腎大鼠中 miRNA-29c 的表達(dá)；A 9 個(gè)差異表達(dá)的 miRNAs；B Taqman qPCR 驗(yàn)證 miRNA-29c 在殘腎大鼠中表達(dá)下調(diào)，而在 L - 含羞草素處理組中得到恢復(fù)；C pri-miR-29b2/ c 初始轉(zhuǎn)錄本在 L - 含羞草素處理后也得到了上調(diào)；D MiR-29c 的表達(dá)量，HIF- α 的表達(dá)量及 HIF- α 蛋白的表達(dá)量隨著時(shí)間的變化。
參考文獻(xiàn)
Fang Y, Yu X, Liu Y, et al. miR-29c is downregulated in renal interstitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF-α activation[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 2013, 304(10): F1274-F1282.
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