研究背景

結直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）在全球范圍內是發病率第三、致死率第四的高發癌癥。CRC 包含腺癌、類癌、肉瘤和淋巴瘤等，較為常見的是腺癌，占比高達 95%。這篇多組學文獻是湯富酬教授和付衛教授團隊聯合發表于《GUT》，家族性腺瘤性息肉病（Familial Adenomatous Polyposis, FAP）是 CRC 的一種特殊病例，是由 APC 抑癌基因胚系突變導致的常染色體顯性遺傳的結直腸腺瘤綜合征，同一個 FAP 患者可能同時取得低級別腺瘤、高級別腺瘤以及腺癌組織，避免了癌癥機理研究中不同患者之間腫瘤組織的個體差異巨大的問題，為研究腺瘤向腺癌轉化的過程提供了天然的研究模型。

研究思路

選取 6 例典型 FAP 患者、1 例非典型 FAP 患者（MUTYH 突變相關的結直腸多發腺瘤）通過全基因組淺測序和全外顯子組深測序，深入的研究了來自于同一個 FAP 患者的多個病變組織之間的譜系發生關系以及良性腺瘤向惡性腺癌轉變過程中的基因組變異情況。同時，為了研究腺瘤發生及腺瘤向腺癌惡變過程中的轉錄組動態變化，對 6 例典型 FAP 患者、1 例非典型 FAP 患者以及 2 例對照散發結直腸癌患者的 8757 個細胞進行了單細胞轉錄組測序。并以這些單細胞轉錄組數據為基礎，重構了腺瘤發生以及腺瘤向腺癌惡化的轉錄組動態變化過程，系統的闡述了該過程中重要的基因表達變化事件。

研究結果

首先在基因組水平上（全基因組重測序和全外測序）比較來自于同一個患者的不同病變階段的腺瘤和腺癌組織，發現相對于癌旁組織，即使是低級別腺瘤的體細胞突變數目已經明顯增多。良性的高級別腺瘤的體細胞突變數目甚至可以比惡性腺癌的體細胞突變數目還高。出現頻率高的潛在體細胞致病突變是抑癌基因 APC 基因。不同患者在其他潛在的致病基因的突變譜上表現出了強烈的個體間異質性。與以前的報道一致，APC 是人結腸直腸上皮細胞中的 gatekeeper 基因，APC 具有高的突變頻率，包括體細胞突變，拷貝中性雜合性缺失和拷貝數變異。

同一 FAP 患者同時取到了低級別腺瘤、高級別腺瘤以及惡變的腺癌組織樣本，這一優勢非常適合于腫瘤克隆演化研究。結果發現病變始祖細胞分裂增殖后遷移到腸上皮組織的不同部位并進一步發展為腺瘤和腺癌。

（A）熱圖顯示來自 FAP1 的所有樣品中體細胞突變的區域分布。

（B）通過使用簡約算法，從 FAP1 到不同病變階段的系統進化樹。

（C）同一細胞來源的示意圖，表明 FAP1 的所有病灶樣本均來自同一病變細胞。

（D）在由體細胞突變構建的 FAP1 的系統樹上呈現了克隆或單個 CNA 和 cnLOH。

FAP 上皮細胞中顯著上調的基因是 OLFM4，該基因被認為腸干細胞和 CRC 細胞亞群的標記物。另一個上調基因 ATF3 是一種致癌的抑制轉錄因子，可由缺氧誘導產生。對 FAP 上調基因的 GO 分析顯示，上調基因在代謝過程中有很強的富集，包括肽生物合成、核苷酸代謝、氨基酸代謝、脂質代謝和碳水化合物代謝過程。MKI67 免疫組化染色證實 FAP 患者正常上皮細胞增殖活性增強。

（A）熱圖顯示 FAP 患者相鄰正常組織的上皮細胞（30 個差異基因）與散發性 CRC 患者相鄰正常組織的上皮細胞（15 個基因）之間的差異。

（B）與 CRC 正常結腸上皮相比，在 FAP 結腸上皮中顯示更高表達水平的基因的基因本體分析。

（C）FAP2 鄰近正常組織和 CRC 患者（非 FAP）鄰近正常組織中 MKI67 的免疫組織化學染色結果。

前述證據已說明來自同一病例的所有腺瘤腺癌樣本均來自同一細胞，那么這些樣本的轉錄組異質性情況如何呢。研究人員通過 tSNE 分析，將來自 FAP1 的所有上皮細胞分為四個簇。簇 1 和簇 2 主要由來自腺瘤 1 的三個區域（Ade1R1，Ade1R2 和 Ade1R3）和癌的第二區域（CarR2）的細胞組成。第三個簇主要由腺瘤 3（Ade3）和癌的第三區域（Car region3）的細胞組成。簇 4 主要由癌的一區域和四區域（CarR1 和 CarR4）的細胞組成。ANG，ANPEP 和 FGL1 在簇 2。與來自其他簇的細胞相比，簇 4 的細胞顯示出不同的轉錄組特征。在簇 4 中特異性表達的基因在 WNT 信號傳導途徑、細胞增殖的負調控、上皮層的形態發生和細胞連接富集。

利用來自 FAP 患者癌旁組織、低級別腺瘤、高級別腺瘤、以及腺癌的上皮細胞之間的系統比較探究了腺瘤發生以及腺瘤向腺癌轉變過程中轉錄組的動態變化。擬時序分析結果顯示將隨腫瘤發展呈現動態變化的基因按照其變化趨勢分為了 4 類。三羧酸循環相關的代謝基表達因在良性腺瘤發生的早期就開始明顯下調，反而在從良性腺瘤到惡性腺癌的轉變過程中有所回升，但仍然低于癌旁組織中正常上皮細胞中的水平。這說明三羧酸循環代謝水平的降低是腫瘤發生過程中較早期事件之一，可能是治療 FAP 患者的較好的治療靶點通路。

這項研究實屬基因組和轉錄組兩大層次的強強聯合，利用全基因組重測序和全外測序組合揭示出 FAP 基因組變異圖譜，利用單細胞轉錄組測序構建了首張 FAP 轉錄組圖譜。全基因組重測序和全外測序的組合可以得到更加全面的更加全面的 SNV/InDel/CNV 變異信息，全基因組重測序覆蓋全面均一，CNV 檢測準確；全外測序針對外顯子區設計，在相同的通量下測序深度高，有利于 SNV、InDel 的檢測。

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