蛋白質(zhì)檢測(cè)首先我們想到的是質(zhì)譜（(mass spectrometry）技術(shù)。

質(zhì)譜技術(shù)： 通過(guò)對(duì)化合物分子進(jìn)行電離，生成不同質(zhì)荷比（m/e）的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖。質(zhì)譜圖中的橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比值，縱坐標(biāo)表示離子流的強(qiáng)度。

蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，在應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了很多具體的方法：

• 不帶標(biāo)記的 label free

• 帶標(biāo)記的 iTRAQ（isobarictags for relative and absolute quantitation, 同位素標(biāo)記相對(duì)和 jué對(duì)定量）

• 帶標(biāo)記的 TMT（Tandem Mass Tags, 串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽）

• 非常高級(jí)的似乎全能的 DIA（Data Independent Acquisition, 數(shù)據(jù)非依賴(lài)性采集）

• 低通量的 PRM（Parallel Reaction Monitoring, 平行反應(yīng)監(jiān)視）

 Label free 是基礎(chǔ)的了。與帶標(biāo)記的 iTRAQ 和 TMT 相比，樣本不加標(biāo)簽，每個(gè)樣本單獨(dú)上機(jī)。只分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。由于它的技術(shù)原理所限，對(duì)儀器的穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)人員的操作等可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的因素要求極高，進(jìn)而造成數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差。當(dāng)然 label free 也有自己的優(yōu)勢(shì)，由于價(jià)格比較便宜，在臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)由于很多情況下都有十來(lái)個(gè)重復(fù)可以降低單個(gè)樣品定量不準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)，也就是說(shuō)那種一測(cè)大幾十個(gè)、上百個(gè)的時(shí)候還是可以選擇的。還有一種情況，部分老師僅僅是想看看蛋白“有還是無(wú)”的，也是可以用 label free 的。還另有適用情況，比如泛素化修飾檢測(cè)只能用 label free，這個(gè)我們后面講修飾組的時(shí)候再細(xì)講。

iTRAQ/TMT 是都是先將蛋白進(jìn)行標(biāo)記的，只是標(biāo)記的基團(tuán)不同。以 iTRAQ 舉例說(shuō)明，iTRAQ 即同位素標(biāo)記相對(duì)和 jué對(duì)定量，使用同位素對(duì)不同樣品進(jìn)行標(biāo)記，然后將同一批樣品一起上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同的同位素標(biāo)記來(lái)區(qū)分各個(gè)樣品中 不同蛋白的表達(dá)量。優(yōu)勢(shì)是：定量準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，靈敏度高對(duì)樣品要求量低，檢測(cè)蛋白數(shù)量多。缺點(diǎn)是由于同位素標(biāo)記較多的只有 16 種（對(duì)，現(xiàn)在新出了 16 標(biāo)的試劑盒！比以前同時(shí)標(biāo)記的數(shù)量增加了），樣品量大（不考慮生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)大于 16 個(gè)時(shí)）的時(shí)候需要在每次上機(jī)時(shí)加內(nèi)參樣品，增加了成本。樣品量在不是特別多的情況下，iTRAQ/TMT 是目前做蛋白定量的技術(shù)。

圖   label free(A) 和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量（B) 之間的差異。Label free 定量包括兩個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的分析，然后進(jìn)行比較。通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量可以直接比較同位素標(biāo)記的肽對(duì)。LC-MS/MS，液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用。

和上面的三種技術(shù)，非常高級(jí)似乎全能的 DIA 技術(shù)是升級(jí)換代式的進(jìn)步。上面的三種，采用的是 DDA（data-dependent acquisition，數(shù)據(jù)依賴(lài)采集）數(shù)據(jù)采集方式，其策略是對(duì)響應(yīng)高的部分母離子進(jìn)行二級(jí)采集。而 DIA（Data Independent Acquisition，數(shù)據(jù)非依賴(lài)采集）采用了不同的數(shù)據(jù)采集模式：將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，然后對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測(cè)、碎裂，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得樣本中所有離子的信息，實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的機(jī)槍掃射的方式向?qū)椶Z炸方式的采集方式轉(zhuǎn)變。

特別是對(duì)于血液，含有像白蛋白這樣的高豐度蛋白。在常規(guī)質(zhì)譜分析中，那些高豐度的蛋白常常會(huì)將具有意義的低豐度蛋白掩蓋。而 DIA 技術(shù)，無(wú)需去除高豐度的蛋白。

當(dāng)然，DIA 也有其弱點(diǎn)，比如對(duì)儀器的要求、價(jià)格等。所以，也不能完全取代之前的技術(shù)。要根據(jù)需求選擇。

PRM 能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段（如發(fā)生翻譯后修飾的肽段）進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì) / 肽段進(jìn)行 jué對(duì)定量。也就是說(shuō)，是靶向的定量技術(shù)。PRM 和上述的幾種技術(shù)相比，就相當(dāng)于 qPCR 之于二代測(cè)序。因此，可以用來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)組的結(jié)果。當(dāng)然，qPCR 做驗(yàn)證，一般是做的單重 qPCR，而 PRM 可以輕松上到多重，我們?cè)囘^(guò)一次檢測(cè) 50 個(gè)靶標(biāo)。我們“古早”的蛋白驗(yàn)證技術(shù)，像 Western Blot，可以被 PRM 代替的，而且 PRM 也不需要一抗。如果需要檢測(cè)的蛋白多，經(jīng)濟(jì)上算起來(lái)，PRM 更劃算呢！

當(dāng)然，基于質(zhì)譜蛋白檢測(cè)應(yīng)用發(fā)展的還有其它技術(shù)。上面介紹的 5 種技術(shù)是用得較多的。檢測(cè)蛋白的技術(shù)，可能還會(huì)想到免疫。當(dāng)然我們這里要介紹的不是 Western Blot、ELISA 等傳統(tǒng)的免疫技術(shù)，而是高通量的蛋白芯片以及低通量的液相懸浮芯片。

蛋白芯片 類(lèi)似于基因芯片，固相的板面上有整齊地排列著一個(gè)一個(gè)小點(diǎn)，這些小點(diǎn)可能是各種抗體，也可能是各種基因組的蛋白質(zhì)。通過(guò)抗原抗體及顯色反應(yīng)，芯片上顯出或者亮或暗的點(diǎn)，以此篩查各種信號(hào)通路、蛋白表達(dá)。

細(xì)胞因子（cytokines）是由免疫細(xì)胞（如單核、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）和某些非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，Miliplex 檢測(cè)的是各種液體，包括體液、灌洗液。

以上，我們介紹了基于質(zhì)譜和基于免疫反應(yīng)兩大類(lèi)常見(jiàn)的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。下面幾回，我們會(huì)進(jìn)行一些案做的分享。 有了 RNA-seq,，還需要蛋白質(zhì)檢測(cè)嗎？