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上一期小編給大家分享了編輯部評論文章，介紹了克服新冠病毒變異潛在耐藥性的方法。今天小編繼續(xù)帶領大家欣賞本期 Cell Research 上的 RNA 甲基化研究成果。希望通過以下 RNA 甲基化研究文獻的研讀，明確在該期刊上發(fā)表文章需要做到的深度和采用的技術手段。當然，重要的是通過這篇文章，一起了解一下伯豪公司能夠在該領域帶給大家什么技術服務。

好了，開始本期的文獻之旅~

大部分從編碼基因剪接而來的環(huán)狀 RNA (circRNAs) 大部分含有開放閱讀框（ORFs)，因此具有編碼蛋白質(zhì)的潛力。目前還不清楚是什么調(diào)控了這些含 ORF 環(huán)狀 RNA 的生物發(fā)生。作者在研究中報道了小鼠精子形成過程中有大量環(huán)狀 RNA 的合成，當晚期粗線精母細胞發(fā)育成圓形，進而拉長為精子細胞時，環(huán)狀 RNA 的豐度增加。對于一部分環(huán)狀 RNA 來說，反剪接似乎主要發(fā)生在富含 m6A 的位點，這些位點通常位于線性 mRNA 的起始密碼子和終止密碼子周圍。大約一半的雄性生殖細胞中帶有大型 ORF 的環(huán)狀 RNA 在其連接處含有 m6A 修飾的起始密碼子，這些特征近期被證明與蛋白質(zhì)編碼潛能有關。利用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測了這些環(huán)狀 RNA 連接序列編碼的數(shù)百個多肽，表明這些環(huán)狀 RNA 確實可以在發(fā)育中的（精母細胞和精子）和成熟的（精子）男性生殖細胞中被翻譯成蛋白質(zhì)。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了 m6A 在編碼環(huán)狀 RNA 的生物發(fā)生中發(fā)揮的新作用，而且還發(fā)現(xiàn)了一種潛在的機制：可以在沒有線性信使 RNA 的情況下，確保穩(wěn)定和持久的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，即通過產(chǎn)生包含大型 ORFs 的環(huán)狀 RNA，并在連接處具有 m6A 修飾起始密碼子。

為了尋找小鼠生精細胞中整個的 RNA 轉(zhuǎn)錄組，作者分別在有或無 RNA 酶 R 處理情況下建立了 RNA 庫，并基于兩個原因采用了 RNA 深度測序：首先，作者希望看到核糖核酸酶 R 處理的 RNA-seq 是否會導致較高 circRNA 注釋假陽性率。其次，是想用總的線性 RNA 作為 circRNA/ 連接 reads 標準化的內(nèi)參。為了加強 circRNA 的發(fā)現(xiàn)比例，作者還采用了近期報道的一種 circRNA 富集方法：RNAse R 處理，然后進行聚腺苷酸化和 poly A + RNA 耗竭（RPAD)。RPAD 方法選擇性地去除了大部分的線性 mRNA，從而從總 RNA 中富集環(huán)狀 RNA，用于構建文庫和深度測序。兩種傳統(tǒng)的 RNA-seq 方法在三種生精細胞類型（粗線精母細胞、圓形和伸長的精子細胞）中環(huán)狀 RNA 的總體表達模式相似，總共有 65,500 個環(huán)狀 RNA 從 rpad -seq 數(shù)據(jù)中被注釋。重要的是，從常規(guī) RNA-seq 數(shù)據(jù)中識別出的環(huán)狀 RNA 中，約 80% 可以在 rpad -seq 數(shù)據(jù)中得到驗證，說明兩種方法的假陽性率相似。考慮到合適的歸一化方法和有限的起始材料，作者決定在以下所有分析中，主要使用從傳統(tǒng) RNA-seq 數(shù)據(jù)中識別的環(huán)狀 RNA(不使用 RNAse R 處理）。

越來越多的數(shù)據(jù)表明，在精子發(fā)生過程中，mRNA 轉(zhuǎn)錄本的整體縮短是通過多聚腺苷酸化信號的活化和精細胞中長 3'UTR 轉(zhuǎn)錄本的選擇性降解來實現(xiàn)的。circRNA 的產(chǎn)生與剪接活性呈正相關。考慮到精子發(fā)生的進程從晚期減數(shù)分裂到單倍體階段選擇性剪接的增強，作者首先測試了環(huán)狀 RNA 的生物發(fā)生的提高是否也發(fā)生在這一階段。作者發(fā)現(xiàn)，當粗線精母細胞發(fā)育成圓形 / 拉長的精子細胞時，獨特環(huán)狀 RNA 的數(shù)量（圖 1a) 和相對豐度（圖 1b，) 都急劇增加。

有趣的是，它們相應的線性形式的水平從粗線精母細胞到圓形 / 拉長的精子細胞這一過程下降，環(huán)狀 / 線形比率顯著增加。

作者通過檢測三種精子形成所必需基因（Ddx4、Spag16 和 Trim37) 的線狀和環(huán)形水平來實驗驗證這一發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)表明，從粗線精母細胞和圓形精子細胞退化為細長精子細胞時，環(huán)狀 RNA 的水平會升高。

GO 富集分析顯示，這些環(huán)狀 RNA 的宿主基因參與了精子發(fā)生過程中的關鍵事件，如表觀基因組調(diào)控（DNA 甲基化、組蛋白修飾和核小體組織）和精子運動（纖毛運動、軸突組裝和微管束形成）。環(huán)狀 RNA 的半衰期要比線性 RNA 長得多，因為它們?nèi)狈ψ杂赡┒耍蚨灰捉到狻？紤]到線性 RNA，特別是那些具有較長 3’utrs 的 RNA，在精子發(fā)生后期正處于積極的降解過程中，環(huán)狀 RNA 水平的升高可能代表了一種機制。通過這種機制，在精子發(fā)生的后期，某些具有特殊重要性的轉(zhuǎn)錄本可以被保留下來，用于蛋白質(zhì)的生成。

重點來了！

近期的數(shù)據(jù)表明，m6A 參與調(diào)控體細胞和雄性生殖細胞的選擇性剪接。在作者近期的研究中已經(jīng)證明，ALKBH5 失活導致 WT 粗線精母細胞和圓形精子細胞中較長 mRNA 轉(zhuǎn)錄本被剪接成較短的轉(zhuǎn)錄本，這些較長的轉(zhuǎn)錄本中存在較高水平的 m6A。這表明 m6A 水平升高的 pre-mRNAs 似乎更緊密地結合剪接小體，從而導致增強的剪接。如果 m6A 參與了這一過程，則 m6A 水平應升高，而 ALKBH5 水平應降低。事實上，根據(jù)作者對 WT 生精細胞的 RNA-Seq 分析，從粗線精母細胞到圓形 / 拉長的精子細胞，Alkbh5 mRNA 水平確實下降。

為了進一步證實 ALKBH5 影響 circRNA 的產(chǎn)生，作者進行了體外的 ALKBH5 敲除和 minigene 報告基因測定。這些數(shù)據(jù)表明，抑制 ALKBH5 確實可能通過增強剪接來提高 circRNA 的產(chǎn)量。

為了進一步建立 circRNA 的產(chǎn)生與 m6A 水平之間的關系，作者進行了 m6A RNA 免疫沉淀，并進行了深度測序（m6A- RIP -seq) 分析。通過對 circRNA 豐度和 m6A 水平的分析，作者發(fā)現(xiàn)環(huán)狀 RNA 越豐富，其所含 m6A 水平越高。這種正相關強烈提示我們環(huán)狀 RNA 是從 m6A 富集位點剪接而來的。如果這個觀點是正確的，那么 m6A 免疫沉淀產(chǎn)物應該含有豐富的環(huán)狀 RNA。事實上，通過使用 m6A-RIP-seq reads 注釋環(huán)狀 RNA，作者觀察到，圓形 / 線形比率從粗線精母細胞到圓形增加，然后到細長的精子細胞進一步增加。m6A- RIP -seq reads 的環(huán)狀 / 線性比顯著高于 RNA-seq，說明 m6A 的環(huán)狀 RNA 連接區(qū)域明顯富集。

作者將這些連接片段分為頭（靠近 5' 端）和尾（靠近 3'端）片段，然后將它們映射到線性 mRNA 上。分析數(shù)據(jù)顯示，這些 m6A - RIP 富集的環(huán)狀 RNA 包含長度可變的 ORF，其中大多數(shù)擁有起始密碼子，有些甚至同時擁有起始密碼子和終止密碼子。

只有少數(shù)來自基因間區(qū)域的環(huán)狀 RNA 被證明可以作為 miRNA 海綿，而大部分編碼基因剪接的環(huán)狀 RNA 含有 ORFs，因此具有蛋白編碼的潛力。近期的一份報告表明，一些含有 ORF 的環(huán)狀 RNA 可以通過 m6A 修飾的起始密碼子作為內(nèi)部核糖體進入位點（IRES) 有效地翻譯成蛋白質(zhì)，而 IRES 可以被 m6A 的讀者 YTHDF3 識別。如果這些 RNA 環(huán)可以被翻譯成蛋白質(zhì)，那么將線性 mRNA 轉(zhuǎn)化成具有編碼能力的環(huán)狀 RNA 將是繞過大量 mRNA 降解并維持某些蛋白質(zhì)持續(xù)產(chǎn)生的理想機制，而這些蛋白質(zhì)對晚期精子形成尤為重要。

在精子發(fā)生的減數(shù)分裂晚期和單倍體早期（粗線精母細胞→圓形精子細胞→細長精子細胞），環(huán)狀 RNA 主要來源于外顯子。有趣的是，通過將頭部和尾部的連接處 reads 映射到全長的宿主線性 mRNA，作者觀察到這些連接似乎在起始密碼子和終止密碼子（圖 3b 中指向兩個峰值的箭頭）中都得到了富集，這表明這些環(huán)狀 RNA 可能含有全長或部分 ORFs.

如果這些環(huán)狀 RNA 是可翻譯的，那么這意味著盡管線性 mRNA 大量降解，部分或全長蛋白仍可在伸長的精子細胞中產(chǎn)生。更有趣的是，作者還觀察到具有更高的循環(huán) / 線性比率的環(huán)狀 RNA (即，circRNA 作為轉(zhuǎn)錄的主要輸出）相對于那些低循環(huán) / 線性比率（即，以線性 RNA 為主要轉(zhuǎn)錄輸出）具有更多完整的 ORF。這些數(shù)據(jù)表明，這些含 ORF 的環(huán)狀 RNA 可以逐漸取代它們的線性形式，這可能是為了即使在線性 mRNA 降解后，仍能維持蛋白質(zhì)的連續(xù)生產(chǎn)。

接下來，作者研究了 m6A 修飾的起始密碼子是否富集在這些環(huán)狀 RNA 的連接位點。對生精細胞的 m6A-RIP-seq 分析顯示，獨特環(huán)狀 RNA 的數(shù)量從粗線精母細胞到圓形和伸長的精子細胞演化過程中增加，并在伸長的精子細胞中達到峰值。進一步對宿主基因的頭（5' 端）和尾（3'端）連接序列比對發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子周圍存在豐富的 m6A，表明這些環(huán)狀 RNA 確實含有 m6A 修飾的起始密碼子?？紤]到 m6A 修飾的起始密碼子可以被 YTHDF3 識別并作為翻譯起始的 IRES，這個發(fā)現(xiàn)表明這個環(huán)狀 RNA 亞群可能是可翻譯的。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在晚期減數(shù)分裂（精子母細胞）和單倍體（精子單體）男性生殖細胞中富集的環(huán)狀 RNA，大多同時包含完整的 ORFs 和 m6A 修飾的起始密碼子。這些環(huán)狀 RNA 很可能是為了維持蛋白質(zhì)的持續(xù)生產(chǎn)，這對晚期精子形成和精子功能至關重要。

為了建立 m6A 和環(huán)狀 rna 之間的因果關系，作者分析了來自 Alkbh5- 和 Mettl3-null 的數(shù)據(jù)。作為 m6A 的擦除劑，ALKBH5 已被證明在精子形成過程中起著關鍵作用。在 alkbh5 缺失的粗線精母細胞中，circRNA 的水平已經(jīng)達到峰值。事實上，與 WT 對照組相比，alkbh5 缺失的生精細胞中圓形 / 線形比率明顯上調(diào)。METTL3 起著 m6A 增加的作用，缺乏 METTL3 已被證明會導致減數(shù)分裂期的生精停滯和男性不育。如果 m6A 水平影響 circRNA 的產(chǎn)生，則 metll3 缺失的生精細胞中 circRNA 的生物發(fā)生應該被下調(diào)。這些數(shù)據(jù)進一步支持了 m6A 影響減數(shù)分裂和單倍體男性生殖細胞中環(huán)狀 rna 產(chǎn)生的觀點。

考慮到環(huán)狀 RNA 比線性 RNA 更穩(wěn)定，作者推測 spermatozoa 中可能存在少量環(huán)狀 RNA。令作者驚訝的是，環(huán)狀 RNA 在精細胞中的含量是精母細胞和精原細胞的 50-100 倍。

作者純化了胞質(zhì)液滴（CDs)，這是一種只存在于附睪精子中的瞬時細胞器，作者發(fā)現(xiàn) CDs 中也含有大量環(huán)狀 RNA。作者分析了全精子和精子頭部的 circRNA 含量，發(fā)現(xiàn)全精子中獨特的 circRNA 數(shù)量是精子頭部的 3 倍，說明大部分環(huán)狀 RNA 定位于精子尾部和連接部位 / 頸部。作者還發(fā)現(xiàn)約 30% 的精源性環(huán)狀 RNA 存在于伸長的精細胞中，說明精源性環(huán)狀 RNA 來源于精子發(fā)生。

為了進一步探索 circRNA 在人類精子中的潛在作用，作者使用 RNA-seq 分析了 circRNA 在高生育（IVF 中妊娠率為 25%) 和低生育（IVF 中妊娠率 <10%) 人類精子中的表達。高生育能力的精子比低生育能力的精子含有更多的環(huán)狀 RNA。與高生育能力精子相比，低生育能力精子中存在更多的線性 RNA。這些數(shù)據(jù)表明，精子中含有大量的環(huán)狀 RNA，這些環(huán)狀 RNA 可能在生命中發(fā)揮作用。

如上所述，環(huán)狀 RNA 的翻譯代表一種代償機制，以確保晚期精子形成的關鍵蛋白的持續(xù)產(chǎn)生。然而，翻譯的直接證據(jù)仍然缺乏。很難明確地證明環(huán)狀 RNA 的翻譯，因為環(huán)狀 RNA 和它們的同源線性形式都具有相同的 ORFs。因此，作者無法區(qū)分檢測到的肽的來源（環(huán)狀 RNA 和它們的線性形式）。由于豐度極低，需要使用基于 LC-MS 的蛋白質(zhì)組學方法來識別這些罕見但獨特的連接肽。將 LC-MS 鑒定的所有肽段與數(shù)據(jù)庫進行比對，從三種生精細胞類型和精子中鑒定出數(shù)百個高可信的連接肽（99%)。作者還在 NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫中對這些連接肽進行了分析，發(fā)現(xiàn)只有 1 - 2 次比對上，表明假陽性率很低（<0.5%)。因此，大多數(shù)（99.8%) 的多肽是環(huán)狀 RNA 的連接序列所特有的。這些數(shù)據(jù)有力地表明，男性生殖細胞環(huán)狀 RNA 在減數(shù)分裂晚期和單倍體男性生殖細胞中積累，并為晚期精子形成和正常精子功能提供持續(xù)的蛋白質(zhì)供應。

目前，RNA 甲基化是機制研究的熱點，已有的研究表明 RNA 甲基化修飾發(fā)生在很多重要的生命進程中。RNA 甲基化檢測的技術主要包括 LC-MS，m6A-seq，m6A-IP-PCR 等。伯豪生物現(xiàn)在已經(jīng)具備提供 m6A-seq 服務的能力，而且富集實驗得到的 motif GGAC 序列可以排在前三位，并且承諾如果不在前三位給客戶免費重新富集。更為重要的是，為了解決前期 m6A-seq 檢測的盲目性等問題，基于質(zhì)譜分析的 m6A 檢測也在緊鑼密鼓的研發(fā)測試中，預計 4 月初就可以為廣大客戶提供檢測服務。

閱讀原文：https://mp.weixin.qq.com/s/ASXqSJr64FcSrUjqpVTDOA